巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

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2024年6月2日发(作者：)

238

西南医科大学学报2020年第43卷第3期

JournalofSouthwestMedicalUniversityVol.43No.32020

论著

巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

晏飞利，李慧，李春红

（西南医科大学药学院药剂学教研室，四川泸州646000）

摘要目的：提取和鉴定巨噬细胞来源的外泌体，为后续开展外泌体相关的研究建立稳定的提取方法，并为当前外泌体

的提取方法提供一定参考。方法：使用超速离心结合过滤法提取鼠源巨噬细胞培养上清液中的外泌体；通过马尔文粒度分析

仪测定其粒径大小和电位，透射电镜观察其形态特征，BCA试剂盒测定外泌体的含量，同时用WesternBlot技术验证外泌体的

特征蛋白CD9和CD63的表达。结果：从鼠源巨噬细胞培养上清液中分离出的外泌体，马尔文粒度分析显示粒径大小为（97.3

±5.73）nm，Zeta电位为-21.26±1.72。透射电镜下观察可见茶托样、均质、具有膜样结构的微小囊泡，直径约100nm；20mL培

养基能分离出约64μg外泌体，WesternBlot实验结果显示特征蛋白分子CD9和CD63在外泌体提取物中表达丰度高，而在提

取后的细胞上清液中没有检测到表达。结论：本研究利用超速离心结合过滤法成功分离了鼠源巨噬细胞来源的外泌体，其形

态均匀，提取含量及纯度较高。

关键词巨噬细胞；外泌体；提取；鉴定

中图分类号R331文献标志码Adoi：10.3969/.2096-3351.2020.03.006

Isolationandcharacterizationofexosomesderivedfrommacrophages

YANFeili，LIHui，LIChunhong

DepartmentofPharmaceuticalSciencesofSchoolofPharmacy，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，

SichuanProvince，China

AbstractObjective：Toisolateandcharacterizemacrophage-derivedexosomesforconstructingastableisola⁃

tionprotocolforfuturerelevantresearch，s：

Exosomeswereisolatedfromtheculturesupernatantofmurinemacrophagesbyultracentrifugationandfiltration.

Thesizeandzetphologicfea⁃

tentofexosomeswasmeasuredusingaBCA

nblots：Theexo⁃

someshadasizeof97.3±5.73nmandazetapotentialof-21.26±1.72accordingtotheMalverngranulometer.

Theywerehomogeneous，saucer-like，andmembrane-likemicrovesicleswithadiameterofabout100nmunder

imately64μ⁃

ernblotshowedhighexpressionofCD9andCD63intheexosomeisolates，butnoexpressioninthecellsupernatant

sion：Wesuccessfullyisolatedexosomesfrommurinemacrophagesbyultracentrifugationand

filtration，withhomogeneousmorphologyandhighcontentandpurity.

KeywordsMacrophage;Exosome;Isolation;Characterization

外泌体（exosome）是一种体内细胞天然分泌的

纳米级的膜囊泡（[40~120）nm]，与细胞的生物学功

能及细胞间的信号传递有着密切的关系，在多种疾

病的诊断及治疗等领域发挥重要作用，因而备受研

究人员的关注

[1-3]

。Exosome作为内源性载体较传统

的纳米递药系统具更多优势：①具有更低毒性和免

疫原性

[4-5]

；②Exosome的纳米结构使得其更容易穿

透生物屏障、逃脱内皮网状细胞的吞噬，同时能够更

好的蓄积于组织微环境中，将药物递送至细胞内，从

而提高药物的递送效率

[6]

；③其磷脂双分子层结构被

可变形的细胞骨架和“凝胶样”的细胞质增强，使

exosome在体内转运过程及与大量可溶性成分共存

基金项目：国家自然科学基金（81803478）；四川省科技厅创新苗子工程项目（2017RZ0048）

第一作者简介：晏飞利，女，2017级硕士生

通信作者：李春红，女，副教授，博士。E-mail：********************

第3期晏飞利等：巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

时，

exosome

依然保持其完整性。这些独特的优势均使得

具有成为理想递药系统的潜力

[7-9]

，本研究

拟对外泌体作为药物载体进行后续研究，但此研究

所需外泌体量大，高效简便的提取方法是开展研究

的基础。

目前外泌体的提取方法主要有：试剂盒法、超速

离心法（差速离心）、蔗糖密度梯度离心、色谱法、超

滤离心、磁珠免疫法、试剂提取法等

[10-11]

。其中常用

的方法有两种，一种是利用吸附性材料与外泌体络

合进而将外泌体沉淀并收集的试剂盒提取法，这种

方法提取产量较低且费用较高

[12]

。另一种是将收集

的含有外泌体的细胞培养基进行超高速离心，将其

沉淀并收集的超速离心法，该法适用于大体积样品

的处理，但提取耗时较长

[13]

。为了节约超高离心时

间，本研究在培养基处理过程中，加入了培养基过滤

的步骤，一方面可以缩短超高离心法所需时间，另一

方面可以排除大囊泡对外泌体纯度的影响。本实验

进行了外泌体提取方法的研究，并对所提外泌体进

行相关表征和鉴定，测定了其含量。本实验的报道

的外泌体提取方法简便、高效，为后续巨噬细胞外泌

体的相关研究奠定了必要的实验基础。

1仪器与试药

小鼠巨噬细胞RAW264.7（中国科学院，上海）；

全自动细胞计数仪（Nexcelom，美国）；艾柯超纯水机

康宁科技发展有限公司，成都）；QYH-S2恒温水浴

锅（乔跃电子有限公司，上海）；WJ-80A-Ⅲ二氧化碳

细胞培养箱（新苗医疗器械制造有限公司，上海）。

低温智能超速离心机OptimaXPN-100（Beckman，美

国）；透射电子显微镜H-7650（Hitachi，日本）；纳米

粒度仪NanoZS90（Malvern，英国）；电泳仪和电转仪

Bio-Rad

基、青霉素－链霉素和胎牛血清

0.22

，

μ

美国

m滤膜

）。

（Millipore，美国

（

）

Gibco

；RPMI

，美国

1640

）；

培养

BCA

蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，上海），兔单克隆抗

体CD63、CD9和HRP标记的羊抗兔IgG（Abcam，英

国

ma

）

酸铵、

，

。

美国

SDS-PAGE试剂盒、PVDF膜、ECL显影液（Sig⁃

脱脂奶粉

）；十二烷基苯磺酸钠

（Beyotime，上海

（

）

SDS

。

）、Trisbase、过硫

2方法

2.1巨噬细胞培养

RPMI

采用含10%胎牛血清和1%的青霉素-

条件37

1640

℃、

培养基培养

5%CO

右，弃掉培养基，用

2

。待细胞生长密度达到

RAW264.7巨噬细胞，

链霉素的

培养箱

PBS缓冲液清洗细胞3次，

90%

并以

左

不含血清和抗生素的培养基培养细胞。24h后，收

集细胞上清液，用于提取外泌体。

239

2.2外泌体的提取

4

4

℃、

外泌体提取流程见图

1000×g离心10min

1，首先将收集的培养基

留取上清液，

℃、12000×g

除去细胞及细胞碎片，再

200

用

离心

0.22

30

μ

min

m

除去细胞器等微小颗粒，

离心

nm

90

的颗粒，

min，离心结束得到的沉淀即外泌体，

最后将过滤后的液体

滤膜过滤以除去粒径大于

4℃、120

用

000

PBS

×g

（pH=7.4）缓冲液重悬后储存于-80℃冰箱待用。

细胞培养上清

去除细胞

1000g，10min，4℃

上清液

去除细胞及碎片

12000g，30min，4℃

上清液

去除大于200nm颗粒

0.22μm滤膜过滤

上清液

12000g，90min，4℃

沉淀外泌体

PBS液重悬

外泌体

图1外泌体的提取流程图

2.3外泌体的粒径和Zeta电位的测定

取外泌体悬液50μL，用1mLup水稀释，室温平

衡2min后，用马尔文仪检测外泌体粒径和电位，重

复3次。

2.4BCA试剂盒测定外泌体的含量

外泌体的含量按照BCA试剂盒说明书进行，具

体如下，首先配制一系列浓度梯度的牛血清白蛋白

标准液

μ

（0ng/μL、5

度标准品取

L、60ng/μL

10

、80

μL

ng/

ng/

加入

μ

μ

L、

L

96

100

、10

孔板中，

ng/

ng/

μ

μ

L

L

）

、

并设置

，

20

接下来每个浓

ng/μL、40ng/

3个复孔，

用于标准曲线的制作。同时，

μ

加显色液

L加入样品孔中，设置

取待测外泌体悬液10

nm

200μL，室温孵育

3个复孔。加样完毕后，

20min，用酶标仪于

每孔

595

白含量。

处测定吸光度，绘制标准曲线并计算外泌体的蛋

2.5透射电子显微镜观察外泌体形态及大小

取外泌体悬液20μL滴加于铜网，静置1min后

用滤纸吸干剩余液体，随后滴加2%磷钨酸溶液3滴

室温复染5min，滤纸吸干剩余液体，室温晾干。于

透射电子显微镜下观察，并拍照记录外泌体的形态

大小。

2.6WesternBlot实验

首先，按照SDS-PAGE试剂盒配制10%分离胶

和4%浓缩胶，灌胶制备胶板，同时取含10μg外泌体

的溶液和超高离心后的细胞上清液

1.5

20μL（对照）于

沸水煮

mLEP

5min

管中，

使样品中的蛋白变性；

加SDS上样缓冲液至终浓度为

然后取15μL

1×

煮

，

（

（

240

沸变性后的样品加入到上样孔中，以恒定电压进行

电泳分离。接着采用湿转法将蛋白从聚丙烯酰胺凝

胶上转移至

ECL

PVDF膜上。最后与相应抗体孵育，加

带。

显影液显影后，用凝胶成像仪拍照记录蛋白条

3结果

3.1外泌体的粒径和Zeta电位

马尔文检测外泌体的粒径及电位，见表1，外泌

体的粒径集中在（97.3±5.73）nm，多分散系数（PDI）

为

Zeta

0.31

布见图

电位测定值是

±2.33，呈现较窄的分布范围，

2，显示大多数外泌体的粒径集中在

-21.26±1.72。外泌体的粒径分

分布较均匀。

100nm

左右。

表1外泌体的粒径和Zeta电位

测定项目粒径PDIZeta电位

测定值97.3±5.730.31±2.33-21.26±1.72

图2外泌体的粒径分布图

3.2外泌体形态大小

透射电子显微镜观察RAW264.7细胞来源的外

泌体，结果显示外泌体呈形态均一的类球形，直径约

为100nm。其外部有完整的双层膜性结构，内部则

含有低电子密度的物质。有些外泌体呈单个散状分

布，有些外泌体则聚集分布，见图3。

图3外泌体的形态图

3.3外泌体的含量

根据不同浓度蛋白标准品在595nm处的吸光

度值，以蛋白标准品的浓度为横坐标，以595nm的

吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图4。根据标准

曲线计算待测外泌体蛋白的浓度。从20mL细胞培

养基中提取的外泌体，最后分散于400μLPBS缓冲

西南医科大学学报

JournalofSouthwestMedical

2020

University

年第

Vol.43

43卷

No.3

第

2020

3期

液中，

ng/μL，

经计算其外泌体蛋白浓度约为

所收集

（160

2.5

RAW264.7细胞外泌体共计约64

±5.32

μg。

）

A=46.662C+0.1072

2.0

R

2

=0.9996

1.5

度

（

A

）

光

吸

1.0

0.5

0.0

0.000.010.020.030.040.05

浓度（ng/μL）

图4BCA标准曲线

3.4Western

外泌体中有表达，

Western

Blot

blot

实验

结果见图

且表达丰度较高，

5，CD63和

而在超高速离心

CD9均在所提

后的上清液中没有检测到表达，说明经提取后上清

液已不含外泌体，进一步验证了该法能从细胞上清

液中高效提取外泌体。

外泌体上清液

图5WesternBlot结果

4讨论

本研究采用Qu等报道的一种改良的外泌体提

取方法进行外泌体的提取

[14]

，在超高离心之前加入

了过滤的步骤，

PBS

省去了常规超高离心法中，最后需用

体更纯净这一步骤，

重悬外泌体后再进行

减少了离心时间，

1~2次超高离心以使外泌

而且所得外泌

体纯度高，粒径分布均匀。外泌体是细胞分泌的众

多囊泡中的一种，

crovesicles）和凋亡小体

细胞外囊泡还包括细胞微泡

（apoptoticbodies）

（mi⁃

[15-16]

。这3

种外囊泡在直径上有所差异，外泌体粒径大多集中

在

100

30

使用

~

~

0.22

1000

150

um

nm

nm，

滤膜过滤细胞上清，

和

而细胞微囊泡和凋亡小体分别在

100~5000nm之间。因此提取中

可以减少大直径囊

泡对外泌体纯度的干扰。

目前对于外泌体的鉴定分析主要有粒径测定、

透射电镜观察形态、蛋白免疫印迹表征特异蛋白以

及流式技术等

[17-19]

。本研究中，透射电镜观察到的外

泌体大小与粒径测定结果一致，约100nm左右，外

第3期晏飞利等：巨噬细胞来源外泌体的提取与鉴定

泌体形态呈茶杯样，具有双层膜包裹的囊性结构，这

与以往文献报道结果完全一致

[20]

20

量较高，

mL细胞培养上清液可提取约

。BCA结果显示，

能满足后续实验的需求。

64ug外泌体，提取

Alix

外泌体特异性表达CD9、

在其中高表达

、TSG101等分子，

[21-24]

。本研究选择了

其中CD9、

CD63

CD63

、

CD9

、

CD81

和

Alix

、CD82、

CD63

、TSG101

进行

检测，结果显示，CD9和CD63在外泌体样本中的表

达丰度较高，说明所提外泌体符合要求且纯度较高，

而上清液中没有检测外泌体的特征蛋白，进一步证

明了超高离心法所用的转速和时间基本能将外泌体

提取完全，这与BCA结果显示的外泌体含量较高相

互印证。

5结论

RAW264.7

本研究利用超速离心结合过滤法提取巨噬细胞

行了鉴定并综合考察了其均匀性、

来源的外泌体，对该方法提取的外泌体进

提取量和纯度等，

证实了该方法用于提取巨噬细胞来源外泌体的可行

性，为后续开展巨噬细胞RAW264.7外泌体相关的

研究奠定了必要的实验基础，并为当前外泌体的提

取提供了一定的参考。

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（2019-12-09收稿）

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本文标签： 外泌体细胞提取蛋白粒径