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2024年7月18日发(作者:)
广东医学2011年1月第32卷第1期 Guangdong Medical Journal Jan.2011,Vo1.32,No.1
・
37・
selalm—free suspension culture[J].Stem Cells,2004,22(7):
1218一l238
[15]DAHLSTRAND J,LARDELLI M,LENDAHL U.Nestin mRNA
expression correlates with the central nervous system progenitor cell
state in many,but not all,regions of developing central nervous
[14]KALLOS M S,BEHIE L A,VESCOVI A L.Extended serial pas—
saglng of mammalian neural stem cells in suspension bioreaetors
system[J1.Brain Res Dev Brain Res,1995,84(1):109—129.
(收稿日期:2010—08—12编辑:张素文)
[J].Biotechnol Bioeng,1999,65(5):589—599.
重组hIL一1 0对皮肤移植家兔T细胞
凋亡及IL一2的影响术
李阳飞,王春梅 ,孙万邦,张磊,温琼娜,刘凯山
遵义医学院珠海校区生理学教研室(广东珠海519041)
【摘要】 目的探讨重组hIL一10诱导皮肤移植家兔与外周血T细胞凋亡的关系。方法将18只受体家兔
随机分成重组hlL~10实验组[低剂量5 g/(kg・d);高剂量10 (kg・d)],CsA阳性对照组[低剂量5 mg/
(kg・d);高剂量10 nlg/(kg・d)],hIL一10+CsA联合组[5 g+5 mg/(kg・d)],生理盐水阴性对照组(1 mL/d)
共6组,每组3只;供体l8只。实验组及对照组均在术前1 d至术后9 d持续肌肉注射药物,并观察各组移植术后
皮片情况。流式细胞仪检测各组家兔术后1…4 7 14 d外周血T细胞凋亡率的变化。用ELISA法检测家兔术后1、
4、7、14 d血清中细胞因子IL一2的变化。结果 重组hI1 一10组与生理盐水组皮片平均存活时间相比较,存在显
著性差异(P<0.05)。hlL一10+CsA组皮片存活时间与低剂量重组hIL一10组及低剂量CsA组比较有明显差异
(P<0.05)。重组hIL一10组术后T细胞凋亡率随着时间逐渐升高,血清IL一2的水平逐渐降低,与阴性对照组比
较差异有显著性(P<0.05),其作用呈剂量依赖性;hlL一10+CsA组与单独用药的低剂量重组hlL一10组及低剂
量CsA组相比,外周T细胞凋亡率升高,血清IL一2的水平下降,差异有显著性(P<0.05)。结论 重组hIL一10
对家兔皮肤移植排斥有抑制作用,延长移植皮片存活时间,其机制可能是通过诱导外周血T细胞凋亡,下调外周
血IL一2水平,实现免疫抑制,或与诱导免疫耐受有关。
【关键词】 重组人白介素10;皮肤移植;细胞凋亡;白介素2
白细胞介素10(interleulin 1O,IL一】0)是Florentine
科生物技术有限公司),IL一2 ELISA试剂盒(晶天生
等于1989年发现小鼠Th2细胞株D10.G4.1产生的一 物公司),5810R方式冷冻离心机(德国eppendorf公
种抑制Thl细胞株细胞因子RNA转录的冈子,称为细 司),流式细胞仪(FCM,EPICS,XL美国BD公司),酶
胞因子合成抑制因子。随后发现IL一10可由多种细
标仪(Bio—TEK公司)。
胞分泌,如单核细胞、巨噬细胞、Th2细胞、B细胞、肥大
1.2 方法
细胞等,并且参与多种细胞的生物调节,是机体重要的 1.2.1 家兔皮肤移植分组将皮肤移植家兔分为6
免疫调节因子之一,具有抑制免疫活性细胞的激活和 组(见表1)。家兔无菌皮肤移植手术后,缝合固定,单
细胞因子产生的作用,参与T细胞免疫反应的调节,抑
笼饲养,动态观察皮片生长情况并做好记录。移植前
制T细胞的激活,诱发T细胞的无效应答…,诱导T细 1 d开始用药,持续10 d。
胞的免疫耐受。有研究表明IL一10和抑制移植排斥
表1 家兔皮肤移植实验分组及给药
有密切关系,并具有一定的治疗前景。本文旨在探讨
重组hIL一10抑制家兔皮肤移植排斥是否诱导了T细
胞凋亡,探讨其相关性及其调节机制,为临床移植免疫
耐受的诱导及免疫抑制剂的合理应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1 主要试剂与实验仪器健康新西兰白兔(分别为
供体】8只、受体18只,体重2 000~2 500 g,遵义医学
院珠海校区实验动物中心提供)。重组hIL一10工程
1.2.2皮肤移植排斥评价若植皮与宿主背部愈合,
菌由遵义医学院珠海校区免疫教研室构建 。环孢菌
色泽一致,炎症和充血不明显,皮片红润、柔软、弹性
素A(CsA,Novartis公司),Annexin—V试剂盒(广州联
好,皮片紧贴创面,无分泌物,干燥则为未发生排斥;以
皮片红肿、有水泡、变硬、翘起,发黑或结痂脱落判定为
贵州省教育厅自然科学研究项目[编号:黔教科(2008032)]
移植排斥,记录开始出现排斥的时间;以移植皮片面积
△通信作者。教授;E—mail:wangchn@yahoo.eoff1.on
的80%出现坏死、发黑视为排斥时间 ,移植皮片未
.
38. 广东医学2011年1月第32卷第1期 Guangdong Medical Journal Jan.2011,Vo1.32,No.1
表2 AnnexinV法检测家兔术后不同时间
出现完全排斥时间为皮片存活时问,全程观察28 d。
1.2.3外周血T细胞凋亡检测 移植家兔皮肤术后
1、4、7、14 d,取家兔外周血,用流式细胞仪检测T细胞
凋亡。方法:(1)取2 mL全血用PBS按1:1稀释;(2)
组别
hlL一10低剂量纵
外周T细胞凋亡率
术后1 t{ 术后4 d 术后7 d
(i±5)%
术后14 d
l1.05±0.74 3O.18±1.88 32.41±2.24
28.0o±4.1
将稀释后的全血小心加到淋巴细胞分离液上层(勿
混),2 000 r/min离心8 min;(3)取单个核细胞层于另
一
hlL一10高剂量组
13 05±0.94 32 46±3 87 36.56±3.78 33.11±2.97
CsA低剂量组
12.67±3.82 30.24±3.4 33.67±3 4 3O.11±4.09
试管中,加2 mL PBS,1 000 r/rain离心5 rain,弃上清
CsA高剂量组
14.82±3.40 36.85±8.24 40.52±3.15 35.50±0.53
液,重复1次;(4)调整细胞浓度1 X 10。/mL,取100 L
细胞液+AnnexinV—FITC 51 L及5l L PI混匀;(5)
6.62±4.96 36 60±2.97 39.72±5.89 34.37±3.4
hIL一10+CsA组
1
阴性对照组
8.23±】.27 14.40±3.01 l8.30±1.33
l1.23±1.82
避光室温20 min;(6)加缓冲液300 ,上流式细胞仪
分析;(7)采取氩离子激光器(功率15 mV)发射的488
mm波长作为激发光源,细胞获取及分析,cellquest软
件下进行。
1.2.4血清IL一2检测家兔皮肤移植术后1、4、7、
14 d分别采集家兔静脉血,分离血清,作IL一2检测。
检测操作严格按IL一2 ELISA试剂盒说明书进行。
1.3统计学方法数据用SPSS l3.O软件进行统计
学处理。同一时问点组间比较用t检验,不同时间点
的组内比较用方差分析,检验水准为0.05(双侧)。
2结果
2.1 术后家兔移植皮片存活时间 生理盐水组在各
实验组中皮片存活时间最短,皮片平均存活时问为
(7.66±1.15)d。重组hIL—l0组家兔术后移植皮片
柔软,色泽红润,边缘整齐,张力适中,无渗 。直到第
7天低剂量重组hlL一10组家兔皮片开始由红润逐渐
变为灰暗、干燥,从周边向中央变硬,边缘逐渐翘起,皮
片平均存活时间为(13.33±3.05)d;高剂量重组hIL一
10皮片平均存活时间为(16.00±2.00)d。重组hIL一
10组与生理盐水组皮片平均存活时问相比较,差异有
显著性(P<0.05)。高剂量CsA组在用药期间均未
现排斥坏死现象,皮片平均存活时间为(21.33±1.52)
d,但受体在用药期问食欲不振,大小便明显减少,毛发
易脱落,精神状态欠佳,用药停止后好转。重组hIL—
l0组无此现象,考虑与CsA的不良反应有关。hIL一
10+CsA组皮片存活时间较长,为(19.00±1.73)d,皮
片存活时间最长的1只家兔术后第21天才开始出现
排斥,皮片存活时间与低剂量重组hIL一10组及低剂
量CsA组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.2 AnnexinV流式细胞仪检测外周T细胞凋亡的结
果重组hIL一10组术后T细胞凋亡率随着时间逐渐
升高,在术后第3天明显增加,术后第7天达到高峰;
与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05)。高剂量
重组hlL一10组术后T细胞凋亡率较低剂量组明显增
高;重组hlL一10组与CsA组术后外周T细胞凋亡率
相比差异无显著性(P>0.05);hIL一10十CsA组与生
理盐水阴性对照组比较,差异有显著性(P<0.05);hIL
一
1O+CsA组与单独用药的低剂量重组hIL一10组及
低剂量CsA组相比,外周T细胞凋亡率升高,差异无显
著性(P<0.05),见表2。
2.3血清IL一2水平ELISA检测结果术后各用药
组家兔血清IL一2的水平与生理盐水阴性对照组相比
均有不同程度的降低。重组hlL一10组与生理盐水组
相比,血清IL一2水平下降,差异有显著性(P<0.05),
并且高剂量重组hIL一10组的血清IL一2水平下降更
为明显。CsA组与生理盐水阴性对照组相比,血清
IL一2水平下降,差异有显著性(P<0.05)。重组hlL
一
10组与CsA组相比较差异无显著性(P>0.05)。
hlL一10+CsA组与单独用药的低剂量重组hIL一10组
及CsA组比较,血清IL一2差异有显著性(P<0.05),
与阴性对照组比较下降更明显(P<0.05)。各组家兔
血清IL一2水平ELISA检测结果见表3。
表3各组家兔术后不同时间血清IL一2水平 ( ± )Pg/mL
3讨论
器官移植已成为终末期器官功能衰竭患者唯一且
有效的治疗手段。但目前困扰器官移植发展的因素
中,除了供体来源外,移植免疫排斥和长期使用免疫抑
制剂的不良反应仍是重要的问题。目前,CsA联合应
用糖皮质激素类药物仍为临床控制急性移植排斥反应
的首选治疗药物,但如何克服二者的毒副作用也是急
待解决的问题之一。现普遍认为,解决异体移植排斥
反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官
产生免疫耐受。有研究表明,凋亡是机体维持免疫系
统稳定的重要作用机制。凋亡细胞可以促使相关淋巴
细胞对其特征性抗原识别激活后产生免疫耐受 。T
淋巴细胞是介导异体器官移植排斥反应的主要效应细
胞。T细胞的凋亡提示机体的免疫系统受到抑制,使
免疫应答处于低反应或不反应状态,从而产生免疫耐
受,延长移植物存活时间。有研究表明,外周T细胞凋
亡在诱导T细胞耐受和延长移植物生存方面有重要作
用 。IL一10具有抑制免疫活性细胞的激活和细胞因
广东医学2011年1月肇3 GuangdongMedic—al !!!! 竺. !!, ! : : !:! .39.
子产生的作用,抑制Thl细胞亚群合成细胞因子 研究表明,IL一2缺陷小鼠对共刺激信号的阻断所诱导
TNF~ 、IL一2、IL一4、IFN一-y等,诱导Thl向Th2转
变,改变T细胞亚群及诱导同种特异性耐受的作用。
BACH等 最先提出了移植排斥反应发生时细胞因子
向Thl型偏移的学说,而在耐受状态下,Thl细胞活性
降低,表现为IL一2和IFN一 的表达下降。IL一10与
移植排斥反应有密切关系,并具有一定的治疗前景。
目前移植模型和临床应用中往往用逆转录病毒、腺病
毒甚至脂质体介导的vIL一10基因转染作为基因治疗
手段。在皮肤移植中,郑江红等 研究发现成纤维细
胞介导的IL一10基因疗法显著延长异体皮肤移植的
存活时间,并降低小鼠淋巴细胞的增殖反应,减少IFN
—
、
IL一2的产生及降低NK细胞活性。最近有研究
表明,IL—l0修饰的DCS能诱导对胰岛移植的免疫耐
受,延长胰岛移植物的存活时问,主要是因为IL—l0
能诱导T细胞凋亡及抑制Thl型细胞介导的同种异体
免疫 。
T淋巴细胞的大量凋亡必定会引起参加自身免疫
反应的效应性T细胞数量的减少,从而使得免疫反应
的程度减轻。本研究表明,重组hlL一10抑制组的家
兔皮肤移植术后早期外周血存在较多的凋亡淋巴细
胞,而生理盐水对照组在发生急性排斥反应中,淋巴细
胞凋亡不活跃。术后各组家兔皮片存活时间比较,重
组hIL一10抑制组皮片存活时问比生理盐水对照组明
显延长,提示初始淋巴细胞凋亡在免疫耐受的形成过
程中发挥重要作用,限制了免疫反应,维持了对于同种
异体移植皮肤的免疫耐受,说明重组hIL~10能诱导T
淋巴细胞凋亡。外周T淋巴细胞凋亡的分子机制有两
种:一种是死亡受体介导的凋亡,即活化T淋巴细胞上
可表达大量的死亡受体蛋白(如Fas、IFN—R1、DR6
等),当受体受到刺激时可通过胞内死亡结构域启动信
号转导通路,最终导致细胞的凋亡;细胞因子撤退诱导
的死亡是外周T淋巴细胞凋亡的另一个重要机制,这
些细胞因子主要是IL一2和大量相关因子如IL~4、IL
一
7等在体内外均能促进T细胞生存 。当这些细胞
因子被抑制时,细胞对凋亡就更加易感。卒实验结果
表明,重组hlL一10组家兔术后血清IL一2含量与生理
盐水阴性对照组相比有明显下降,而外周T细胞凋亡
率明显增高,冈此我们初步推测,重组hlL~10诱导外
周T淋巴细胞凋亡的机制可能是通过抑制血清IL一2
的表达。然而,我们发现重组hlL~10组、CsA组及二
者的联合用药组家兔术后血清IL~2含量虽较生理盐
水阴性对照组有明显下降,但在受体的淋巴细胞发生
较多凋亡时,这些受体血清内IL一2浓度稍为升高,说
明术后3~5 d IL一2在淋巴细胞中表达上调。这一发
现也支持与淋巴细胞活化相关的免疫耐受诱导机
制 。J。从某种意义看是自相矛盾,因为IL一2一直以
来被认为是T细胞生长因子,能促进T细胞增殖和分
化,并使活化T细胞转化为效应T细胞。但近年来有
的免疫耐受能够产生抵抗,这种抵抗与同种异体抗原
介导的T细胞凋亡机制受损有关 。在IL一2或功能
性IL一2受体缺陷型小鼠,T细胞耗竭机制有缺陷,结
果在外周堆积的活化T细胞越来越多,于是就增加这
种小鼠对白体免疫性疾病的易感性 。有研究报道,
IL一2在体内的主要作用是使活化T细胞对Fas介导
的凋亡更敏感 。最近有研究报道,过表达外源性IL
一
4和IL—l0的基因治疗能够诱导心脏移植免疫耐
受,主要是因为这种基因治疗策略通过Fas/FasL的相
互作用,能促进同种异体移植后活化T淋巴细胞凋亡,
同时防止心肌细胞凋亡 。一个活化T细胞凋亡所
采取的路径很可能由几种因素决定,这些因素包括涉
及的T细胞亚群、T细胞活化的机制以及活化T细胞
所处的微环境。因此,重组hIL~10诱导外周T细胞凋
亡的机制不单是通过抑制IL一2产生的途径,受体介
导的凋亡及它们之间的相互作用可能都发挥着作用。
是否一种特定的凋亡途径在其中处于支配地位,还需
要进一步研究。
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40・ 广东医学2011年1月第32卷第1期 GuangdongMedical Journal Jan.2011,Vo1.32,No.1
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(收稿日期:2010—07—22编辑:蔡欣)
重组人白介素1 0对低氧条件下人单核细胞凋亡
变化规律的影响水
姚君 ,王立生 ,王建尧 ,李迎雪 ,朱惠明 ,师瑞月 ,张茹 ,莫镜 ,张利国
暨南大学第二临床医学院、广东省深圳市人民医院消化内科(广东深圳518020); 广东省深圳市儿童医院
(518020); 广州医学院第三附属医院(广州510150);4广东省 山市第二人民医院肝胆外科(528000)
【摘要】 目的研究低氧条件下,重组人白介素10(rhlL—lo)对人单核细胞白细胞(THP一1)凋亡和caspase一3
活性变化规律的影响。方法 悬浮培养THP一1细胞株,分为正常对照组(常规培养);低氧(5%0 ,5%CO ,
9O%N,)培养THP一1,rhIL—l0以10、50、J00.g/mL的浓度干预,分为低氧对照组,rhlL一10低、中、高剂量干预
组;培养12、24、48、72 h,离心收集细胞,化学比色法检测细胞核内caspase一3活性,48 h核荧光染色荧光显微镜
观察,分析荧光强度,行统计学分析。结果 凋亡蛋白caspse一3相对活性,12 h各组差异无统计学意义(P>
0.05);24 h低氧对照组及低、中剂量rhII 一10干预组与正常对照组比较升高(P<0.05),高剂量rhIL一10干预组
与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),rhIL一10干预各组与低氧对照组比较降低(尸<0.05);48 h低氧
对照组和rhlL一10干预低、中、高剂量组与正常对照组比较升高(P<0.05),低、中、高剂量rhlI 一10干预组与低
氧对照组比较明显降低(P<0.05);72 h低氧对照组、低剂量rhIL一】0干预组与正常组比较升高(P<0.05),其余
各组差异无统计学意义(P>0.05);缺氧凋亡峰值见于48 h。取48 h行各组凋亡细胞核Hoeehst荧光染色,灰度
值分析低氧对照组和低、中、高剂量rhIL一10干预组与正常对照组比较升高(P<0.05);低、中、高剂量rhlL一10
干预组与低氧对照组比较降低(P<0.05)。结论缺氧可促进单核细胞凋亡,rhll 一10可一定程度地抑制人单核
细胞凋亡,这些变化可能与各器官急性缺氧性疾病有密切相关性。
【关键词】 重组人白介素10;低氧;凋亡;人单核细胞;easpase一3
缺血缺氧是许多疾病中常见的病理现象,可造成
1材料与方法
单核细胞凋亡和坏死,从而影响单核细胞许多重要乍
1.1 材料人单核细胞门细胞(THP一1)由南方医科
理功能和免疫功能的发挥。同时,缺氧导致器官功能
大学细胞生物学教研室邹志鹏老师馈赠。重组人白介
损害,除与细胞能量代谢障碍、代谢性酸叶l毒有关外,
还可能与炎症细胞被激活、炎症因子大量释放有关。
素10(rhIL一10)购于上海欣百诺生物科技有限公司,
IL一10主要由CIM Th,辅助细胞亚群产生,以单体形
编号:(SinoBio—C027)。试剂:CCK一8试剂盒、Ho—
式发挥作用,是细胞免疫反应中最为重要的负性调节
echst一33258试剂盒和capase一3凋亡检测试剂盒购
因子…。它能下调T细胞和 噬细胞转录分泌的
于南京凯基生物科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒
TNF— 、IL一1B、IL一6和IL一8等细胞因子,最终抑
(上海申能博彩生物科技有限公司);RPMI 1640(PPA,
制T细胞介导的细胞免疫反应。【大1此,有抗凋亡作用
Austria);无内毒素胎牛血清(GIBCO)。
的IL一10对单核细胞可能有保护作用。本实验以厌
1.2 方法
氧培养单核细胞建立缺氧模型,研究在缺氧条件下,
1.2.1 细胞培养将THP一1常规培养2 d,细胞浓度
rhlL一10对单核细胞凋亡的影响及作用途径,以进一
调整到5 x 10 ・mL。
步阐明rhlL一10治疗缺血缺氧疾病的机制,也为其用
1.2.2低氧处理、药物干预与实验分组正常对照组
于治疗新的适应证提供线索。
行常规有氧培养;低氧(5%O:,5%CO:,90%N:)培养
组分为低氧对照组,rhlL一10干预组分为低、中、高剂
广东省自然科学基金资助项目(编号:10151802001000002)
量组(分别以rhlL一10 10、50、100 ng/mL的终浓度于
△通信作者。博士研究生导师,主任医师;电话:0755
培养基培养);以上组别培养l2、24、48、72 h后,行相
25533018;E—mail:wangls168@163.Corn
关检测。
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