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2024年6月26日发(作者:)
Reverse Transcriptase XL (AMV)
使 用 说 明 书
Code No.: D2620
包 装:
Reverse Transcriptase XL(5 U/μl) 200 U
5×Reverse Transcriptase XL Buffer 1 ml
保 存:
-80℃冷冻保存(反复冷冻、融解基本不失活,但应尽量避免),-20℃短期保存亦可。
●
制品说明
本酶是由Avian Myeloblastosis Virus(AMV)分离而来的分子量约157,000道尔顿的αβ型全酶
(E.C.2.7.7.7)。AMV反转录酶XL经过高度纯化,不含核酸酶。该酶在37~55℃的温度范围内有活性,
最适温度为41~45℃,在以Tobacco Vein Mottling Virus(TVMV)RNA(约10 kb)作模板的情况
下,AMV RT XL(200 Units/ml)可使60%的模板被反转录,其中25%被合成为全长的cDNA。以
Poly(A)-tailed RNA Ladder(1.4~9.5 kb)作模板时,可使40~70%的模板被反转录,其中55~80
%被合成为全长的cDNA。与小鼠反转录病毒(MMLV)由来的反转录酶不同,本酶在4 mM焦磷酸钠存
在下也能合成cDNA,但此时的最适温度为37~40℃。
●
酶贮存溶液
KPB缓冲液(pH7.2)
EDTA
DTT
Triton X–100
Glycerol
●
起 源:
Avian myeloblastosis virus(AMV)。
●
活性定义
以Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物,在37℃、10分钟内,使1 nmol的[
3
H]dTMP掺入酸不溶性沉淀
物所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
10
0.1
2
0.2
mM
mM
mM
%
50 %
●
纯 度
1) RNase Assay
15 U的本酶和1 μg的RNA Ladder(1.4~9.5 kb)在37℃下反应2小时,RNA的电泳谱带不发
生变化。
2) DNase Assay(Endonuclease、Exonuclease)
50 U的本酶和0.5 μg的φX174 RFI DNA
Hae
III fragments在15 μl反应液中,37℃下反应3
小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
●
用 途
1) 合成单链cDNA。
2) 制作cDNA探针。
3) RNA及DNA的双脱氧测序。
4) RNA的PCR反应。
5) 用引物伸长法组建mRNA 5′末端的物理图谱。
6) 双链DNA 3′凹陷末端的修复。
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添附Buffer组成(保存:-20℃)
5×Reverse Transcriptase Buffer。
Tris-HCl(pH8.3) 250 mM
KCl 375 mM
MgCl
2
40 mM
DTT 50 mM
●
使用例
用于PCR反应的cDNA合成
1. 在微量离心管内配制下列反应液,全量为20 μl。
模板RNA溶液 1 μg
5×Reverse Transcriptase Buffer 4 μl
dNTP Mixture(10 mM each) 2 μl
RNase Inhibitor 20 U
Oligo(dT)
18
Primer
或Random Primer(6~9 mer) 50 pmol
AMV Reverse Transcriptase 10 U
DEPC H
2
O up to 20 μl
2. 轻轻搅拌。
3. 室温放置10分钟后移入42℃恒温槽中。
4. 42℃保温1小时。
5. 在冰水中冷却2分钟。
(所得到的反应液可用于PCR反应。)
V2006.03
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