鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物及方法

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(21)申请号 CN2.3

(22)申请日 2010.05.24

(71)申请人 浙江省林业科学研究院

地址 310023 浙江省杭州市小和山高教园区留和路399号

(72)发明人 李海波 樊琳 沈爱华 江波

(74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公司

代理人 黄美娟

(51)

C12Q1/68

C12N15/11

(10)申请公布号 CN 101899505 A

(43)申请公布日 2010.12.01

权利要求说明书 说明书 幅图

(54)发明名称

鉴别杉木无性系开天3号的分子特

异性标记引物及方法

(57)摘要

本发明提供了一种可鉴别杉木无性

系开天3号的分子特异性标记引物，以及

利用该引物对杉木无性系开天3号进行区

别和鉴定的方法。所述引物序列为：上游

引物：5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-

3′，下游引物：5′-

TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′；本发明检

测方法与常规形态学检测杉木无性系相

比，具有检测时间短，准确性高的优点；

本发明方法检测所需时间只要1～2天。

法律状态

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态

权 利 要 求 说 明 书

1.一种鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′

下游引物：5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′。

2.一种利用权利要求1所述分子特异性标记引物对杉木无性系开天3号进行快速鉴

别的方法，所述方法包括：提取待测杉木基因组DNA作为模板、以所述分子特异

性标记引物作为扩增引物，配制PCR反应体系进行PCR扩增，对扩增产物进行电

泳检测，若电泳结果出现1211bp的DNA条带，则待测杉木为杉木无性系开天3

号，所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′

下游引物：5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR反应体系每20μl组成如下：

PCR Buffer 终浓度为1×

dNTPs 各1.0～2.0mM

MgCl₂ 1.5～2.0mM

Taq DNA酶 1～5U

上、下游引物 各0.5～0.8μM

模板DNA 60～80ng

ddH₂O补足至20μl；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸2min，

共28个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测杉木幼嫩叶片，以SDS-CTAB法提取待测杉木基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，

进行PCR扩增：

PCR反应体系组成如下：

10×PCR Buffer 2μl

10mM dNTPs 3.2μl

25mM MgCl₂ 1.5μl

5U/μLTaq DNA酶 0.5μl

25μM上、下游引物 各0.5μl

20ng/μL模板DNA 3μl

ddH₂O补足至20μl；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸2min，共28个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μl 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂

糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自

动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现1211bp的DNA条带，则待测杉木为

无性系开天3号。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5μg/ml EB的水溶

液中染色30分钟。

说 明 书

(一)技术领域

本发明涉及一对鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物，以及利用该引物

对杉木无性系开天3号进行快速鉴定的方法。

(二)背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.)是我国南方省(区)主要用材、造林树种，

其栽培历史悠久，自然分布区域广泛，生态环境多样。自20世纪50年代以来，以

穗条扦插方式进行的杉木无性系育种工作逐渐开展起来，杉木无性系苗造林在福建、

湖南、浙江、广西等省区也随之得到发展。杉木萌芽性强、易于无性系繁殖，其无

性系个体在形态特征上高度相似，传统的形态特征识别方法由于易受树龄和环境的

影响，很难对其进行准确的分类鉴定。此外，近年来各杉木产区、科研机构间开展

杉木育种材料的交流及引种调拨频繁，再加上各自命名等原因，不仅造成了一定程

度上杉木优良无性系的种源难以区分辨别，也导致了在管理和利用上的混乱局面。

开天3号是经过国家鉴定过的优良杉木无性系，10年生每亩年生产木材2立方米

(蓄积)，平均树高13.5米，胸径15.4厘米，是普通杉木速生丰产林的3倍多。而

且其具有木质不易开裂，抗病虫能力强等特点。是浙江西部最主要的造林无性系。

但是由于开天3号于其他杉木无性系在形态上极为相似，不易区分辨别，影响杉木

的推广与造林生产工作。因此对开天3号无性系的准确鉴别不仅有利于我国杉木资

源的保护、发掘与利用，而且对于指导当前的杉木造林、更好地发挥杉木在我国林

业生产上的巨大作用具有重要的现实意义。

杉木研究在目前已达到分子水平，并已取得一些成效，但在杉木无性系的分子识别

上，目前应用的RAPD、ISSR技术并不理想，不够便捷。其中，RAPD标记的竞

争反应导致其重复性和稳定性较差，而且检测到的谱带通常有5～10条；ISSR在

应用上需要反复摸索建立最适的反应条件，而且不同ISSR标记的反应条件不同。

显然，以杉木无性系的分子识别、鉴定为目的，理想的分子手段应该是针对不同的

杉木无性系设计不同的特异引物，以特异引物的PCR检测获得的稳定DNA谱带作

为特异指纹用于杉木无性系的可靠识别与鉴定。

SCAR(特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD基础上

提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一对18～24碱基的

引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专一性引物的采用排除了随机

引物结合位点之间的竞争，因而它是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、

简便、低成本的特点。到目前为止，在我国杉木种质资源的研究上，除建立了杉木

种子随体染色体的二对SCAR标记外，SCAR标记尚未用于杉木种质资源间的分子

识别与鉴定。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可区别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物，以及一

种利用该引物对杉木无性系开天3号进行快速辨别的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′

下游引物：5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验，采用RAPD标记获得杉木无性系

开天3号的差异DNA片段，将该片段克隆测序，以得到DNA序列为基础设计特

异性引物。以该引物对对杉木无性系开天3号进行PCR扩增，可从杉木无性系开

天3号中获得1211bp大小的特异性片段。

本发明还涉及利用所述分子特异性标记引物对杉木无性系开天3号进行快速鉴别的

方法，所述方法包括：提取待测杉木基因组DNA作为模板、以所述分子特异性标

记引物作为扩增引物，配制PCR反应体系进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检

测，若电泳结果出现1211bp的DNA条带，则待测杉木品种为杉木无性系开天3

号，所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′

下游引物：5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′。

所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，

以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

此外，需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于杉木无性系

开天3号的区分，即待测杉木无性系是限定为杉木无性系开天3号的范围内。由于

杉木之间形态特征差异非常小，市场上将杉木区分辨别错误的情况时有发生，而采

用本发明方法，可对杉木无性系开天3号进行快速区分和鉴定，方法简单、快捷、

准确。

优选的，所述PCR反应体系每20μl组成如下：

PCR Buffer 终浓度为1×

dNTPs 各1.0～2.0mM

MgCl₂ 1.5～2.0mM

Taq DNA酶 1～5U

上、下游引物 各0.5～0.8μM

模板DNA 60～80ng

ddH₂O补足至20μl；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸2min，共28个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与

1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。

10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH8.5)、500mMKCl、

25mM MgCl₂和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH₂O。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测杉木幼嫩叶片，以SDS-CTAB法提取待测杉木基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，

进行PCR扩增：

PCR反应体系组成如下：

10×PCR Buffer 2μl

10mM dNTPs 3.2μl

25mM MgCl₂ 1.5μl

5U/μL Taq DNA酶 0.5μl

25μM上、下游引物 各0.5μl

20ng/μL模板DNA 3μl

ddH₂O补足至20μl；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸2min，共28个循环；

最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μl，与1μl 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖

凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动

凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现1211bp的DNA条带，则待测杉木为无

性系开天3号。

所述EB染色为在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟。

本发明的有益效果主要体现在：本发明检测方法与常规形态学检测相比，具有检测

时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～2天。

(四)附图说明

图1为对杉木无性系进行PCR扩增的结果；M：Marker，即DNA分子量标准；12：

开天3号；箭头所指为编号为12的杉木无性系开天3号扩增出的分子量为1211bp

的特殊DNA条带。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)以杉木幼嫩叶子提取基因组DNA，采用SDS-CTAB法，并使用DNA纯化试剂

盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。纯化的基因组DNA先用1.5％

的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，

GE Healthcare公司)定量检测。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5′-

TCGCCCAGTCGATCAGATAA-3′和下游引物5′-TCGCCCAGTCCACCCTCA-3′，

由上海生物工程技术有限公司合成。

(3)SCAR分子标记的PCR扩增：10×PCR Buffer 2μl，10mM dNTPs(dATP、dCTP、

dGTP、dTTP各10mM)3.2μl，25mM MgCl₂1.5μl，5U/μlTaq DNA酶

(杭州博日科技有限公司)0.5μl，25μM特异引物对各0.5μl，20ng/μl模板DNA 3μl，

ddH₂O补足至20μl。扩增反应在TC-XP型扩增仪(杭州博日科技有限

公司)上进行。94℃预变性6min后；94℃变性40s，63℃退火40s，72℃延伸2min，

共28个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5ul，与1ul 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样

于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，

在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像

分析仪上照相。

按照上述方法，分别对多个杉木无性系(编号1～20代表杉木无性系依次为：1：龙

15号；2：湘5号；3：黔2号；4：福建1号；5：浙江15号；6：湘23号；7：湘

4号；8：浙江16号；9：湘3号；10：浙江5号；11：浙江13号；12：开天3号；

13：黔4号；14：浙江4号；15：湘1号；16：湘12号；17：浙江8号；18：浙

江14号；19：浙江7号；20：浙江2号)进行检测，电泳结果见图1。其中编号为

12的开天3号无性系，扩增出了分子量为1211bp的特殊DNA条带，其余编号为

其它杉木无性系，未见有1211bp的特殊DNA条带产生。

SEQUENCELISTING

<110> 浙江省林业科学研究院

<120> 鉴别杉木无性系开天3号的分子特异性标记引物及方法

<130>

<160> 2

<170> PatentInversion3.4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

tcgcccagtcgatcagataa 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

tcgcccagtccaccctca 18