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2024年6月19日发(作者:)
的区域的RNA通过基于标准RT的方法回收,随后扩增。通过产
定向克隆入表达载体的适合DNA片段的巢式引物PCR扩增进行
轻链:HindIII/BsiWI和重链:HindIII/XhoI。用于此回收过
列从宿主动物基因组的序列分析中得到。新型序列的主
以及小鼠和大鼠。引物序列为:
生用于
步骤2:
程的特异性序
要来源是兔,
entry> 引物 TC 部 GC SEQ ID NO CCC(HindIII/SfuI) GGGCC (BsiWI) (HindIII) 反义外部 反义内部 GCC CC(XhoI)
哺乳动然后将克隆的cDNA连接入能表达重组轻链和重链的两个不同的
物表达载体(κ轻链恒定区和γ-1(γ-1)重链恒定区)。这些
并且并入包括于序列回收中的天然信号序列。
DNA制备,并且通过将两种质粒转染进入
兔/人嵌合抗体的瞬时产生。培养5天后,
且就抗原识别直接测试条件培养基,或经
力纯化重组抗体。
然后使用上述的ELISA方法就抗原识别测试抗体。此外,对于纯
构建体在框架中制备,
对各种表达质粒进行大规模
HEK293细胞,来进行全长
通过离心移除所得的细胞,
由蛋白质A色谱法而亲和
化的抗
体,通过ForteBio Octect测量而建立Kd。最终,测试归因于
用于轻链和重链序列回收的实验性方法
本方法基于制造商对Qiagen One Step RT-PCR试剂盒的说明中所
术。制备通常的主混合物(master mix),并且其包括RNasin
防止RNA降解。将50μL包含0.58μM每步1个引物(引
述的技
与回收序列相关的特定孔的原始功能修饰特性。
(Promega)以
物
的冷冻SEQ ID NO:1、3、5和7)的RT-PCR主混合物添加至包含先前回收
细胞的250μl eppendorf管,并且在冰上小心混合。用下列循
步RT-PCR:(1)50℃,30分钟;(2)95℃,15分钟;
(4)54℃,30秒;(5)72℃,1分钟;(6)进入步
(7)72℃,3分钟;和(8)4℃,保持。
当这些循环结束时,使用1.5μL初次RT-PCR反应物在单独的反
行第二次PCR扩增以回收轻链和重链可变区域。使用下列循环
环方案进行一
(3)94℃,30秒;
骤3,共35个循环;
应中进
方案用
0.4μM第二巢式PCR引物轻链(引物SEQ ID NO:2和4)和重
SEQ ID NO:6和8)进行KOD聚合酶驱动的扩增(Novagen):
钟;(2)94℃,30秒;(3)60℃,30秒;(4)72℃,
35个循环;(6)72℃,3分钟;和(7)4
在完成第二次扩增后,取出10μL反应物并且通过2%TAE琼脂
电泳来分析。剩余的40μL反应物经由Qiagen Qiaquick PCR
盒来纯化,并且洗脱成75μL。
随后使用下列条件消化这些扩增子(轻链用HindIII/BsiWI,重
HindIII/XhoI):10μL纯化的PCR产物、3μL 10×New
性酶缓冲液2、0.5μL HindIII(5U)和0.5μ
下60分钟,然后在55℃下30
链(引物
(1)94℃,2分
45秒;(5)进入步骤2,共
℃,保持。
糖凝胶
Clean-up试剂
链用
England Biolabs限制
L BsiWI(5U)或0.5uL XhoI,在37℃
分钟。该消化物经由
连接入适合的表达载体。然Qiagen Qiaquick PCR方法来纯化。随后将这些
后2μL的这种反应物用于转化TOP10
并且将转化的细胞涂布在LB/
(Invitrogen)或XL-10(Stratagene),
卡那霉素(50μg/mL)上。
使用下列引物经由PCR筛选方法就插入物筛选所得的克隆:
entry> 引物 SEQ ID NO
挑选克隆放至60μL LB/卡那霉素,且温育高达30分钟。在30
约1μL,并用于包含2μM引物对(SEQ ID NO:9/10
分钟时,取出
用于重链和
应(Novagen)。扩增SEQ ID NO:9/11用于轻链)的标准30μL KOD扩增反
方案如下:(1)96℃,2分钟;(2)96℃,20秒; (3)68℃,25秒;(4)进入步
骤2,重复共40个循环;和(5)68℃, 2分钟。
取出5μL,且在2%琼脂糖上进行分析。在证实正确的可变区插入
5μL各种反应物在10μL终体积的New Biolabs限制性酶缓冲
Alul(New England Biolabs)进行消化,并且在4%TAE琼脂
进行分析。鉴定每个回收孔的独特Alu模式。随后对这些
序列表征。
物后,
液2中用
糖凝胶电泳上
进行处理用于
版权声明:本文标题:用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法 内容由热心网友自发贡献,该文观点仅代表作者本人, 转载请联系作者并注明出处:https://www.elefans.com/dianzi/1718809037a727968.html, 本站仅提供信息存储空间服务,不拥有所有权,不承担相关法律责任。如发现本站有涉嫌抄袭侵权/违法违规的内容,一经查实,本站将立刻删除。
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