通用型CD19 CAR-T的体外构建及初步功能鉴定

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2024年6月2日发(作者：)

中国细胞生物学学报

Chinese

Journal

of

Cell

Biology

2021,43(2): 311-318

DOI

: 10.11844/

cjcb

.2021.02.0005

通用型

CD

19

CAR

-

T

的体外构建及初步功能鉴定

蒙露

1

〃赵曰

M

周丹^刘佳慧

4

’

5

张瑶〃张月琴

2

’

6

刘琴

2

,

6

刘洋

2

,

6

张悦夂

7

胡书舶

U

张师琴“

2

李华

4

邹强1^

r

成都医学院基础医学院，成都

610500;2

成都医学院科研实验中心，成都

610500;3

西南交通大学医学院，

成都

610031;4

西部战区总医院，成都

610083;5

成都中医药大学基础医学院，成都

610075;

6

成都医学院药学院，成都

610500;7

川北医学院，南充

637007)

摘要

CAR

-

T

免疫细胞治疗已经在血液肿瘤领域取得突破性进展。然而，目前上市和国内

临床试验的

CAR

-

T

细胞均来自肿瘤患者自身，即自体型

CAR

-

T

。因受制于患者

T

细胞的质量和数量、

制备周期长且价格昂贵等原因，很难将其进行大规模临床应用。该研究利用

CRISPR

7

Cas

9基因编

辑技术敲除健康人脐带血来源

T

细胞的

TCR

分子和

HLA

-

I

类分子，避免异基因细胞治疗引起的免疫

排斥，通过慢病毒载体转导

CAR

基因，制备通用型

CD

19

CAR

-

T

细胞药物。体外验证可减少免疫排

斥，并在体外证明有较强的靶细胞杀伤作用。该方法可提供一种制备通用型

CAR

-

T

细胞的途後，有

望使更多患者得到及时治疗，使重复治疗成为可能；另外，它降低了

CAR

-

T

疗法的制造成本,从而减

轻了患者的治疗负担；最后，它可为临床治疗提供实验依据。

关键词

CAR

-

T

;

CRISPR

/

Cas

9;同种异体;抗肿瘤活性

In Vitro

Construction and Preliminary Functional Identification of

Universal CD19 CAR-T

MENG

Lu

1-2,

ZHAO

Ri

34,

ZHOU

Dan

1-2,

LIU

Jiahui

4-5,

ZHANG

Yao

3'4,

ZHANG

Yueqin

2-6,

LIU

Qin

26,

LIU

Yang

26,

ZHANG

Yue

4’7,

HU

Shubo

'.2,

ZHANG

Shiqin

1.2,

LI

Hua

4,

ZOU

Qiang

1.2*

Basic Medical College of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China 2Scientific Research and Experimental Center of

Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; ^Southwest Jiaotong University School of Medicine, Chengdu 610031, China;

4 Western Theater Hospital, Chengdu 610083, China 5Basic Medical College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,

Chengdu 610075, China、bSchool of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China'

1 North Sichuan Medical College, Nanchong 637007, China)

Abstract

CAR-T

immune

cell

therapy

has

made

breakthrough

progress

in

the

field

of

hematological

tu

­

mors

.

However

,

the

CAR-T

cells

currently

on

the

market

and

in

domestic

clinical

trials

are

all

derived

from

tumor

patients

themselves

,

that

is

,

autologous

CAR

-

T

.

Restricted

by

the

quality

and

quantity

of

patient

T

cells

,

long

prepa

­

ration

cycle

and

high

price

,

it

is

difficult

to

apply

them

in

large-scale

clinical

applications

.

In

this

study

,

CR

1

SPR

7

Cas

9

gene

editing

technology

was

used

to

knock

out

TCR

molecules

and

HLA-I

molecules

in

T

cells

derived

from

healthy

human

umbilical

cord

blood

to

avoid

immune

rejection

caused

by

allogeneic

cell

therapy

.

CAR

gene

was

transduced

by

lentiviral

vector

to

prepare

universal

CD

19

CAR-T

cell

drugs

.

It

is

proved

that

it

can

reduce

immune

收稿日期

:2020-11-11

接受日期

:2020-12-07

四川省科技厅应用基础研宄项目

(

批准号：

19YYJC0242

、

2018JY0440

)资助的课题

*

通讯作者。

Tel: 189****7461

，

E-mail:****************

Received: November 11,2020 Accepted: December 7,2020

This work was supported by the Applied Basic Research Project of Science and Technology Department of Sichuan Province (Grant N

〇

.19YYJC0242,2018JY0440)

*:+86-,E-mail:****************

URL: /?id=5455

312

•研究论文_

rejection

in vitro

and

has

a

strong

killing

effect

on

target

cells

in vitro.

This

method

provides

a

way

to

produce

uni

-

versal

CAR-T

cells

.

Firstly

,

it

is

expected

to

make

more

patients

to

receive

timely

treatment

and

makes

it

possible

to

repeat

treatment

.

Secondly

,

it

reduces

the

manufacturing

cost

of

CAR-T

therapy

,

thereby

reducing

the

burden

of

patients

.

Finally

,

it

provides

experimental

basis

for

clinical

treatment

.

Keywords

CAR

-

T

;

CRISPR

/

Cas

9;

allogeneic

;

antitumor

activity

近年来，肿瘤免疫疗法己成为继手术、放疗和

化疗之后的第四种肿瘤治疗手段。嵌合抗原受体

T

细

胞免疫疗法

(chimeric

antigen

receptor

T

cell

immouno

-

therapy

,

CAR

-

T

)在血液肿瘤的临床试验中取得了令人

瞩目的疗效[

u

，完全缓解率达到70%~90%[2_31。2017年，

FDA

批准上市两款治疗用自体型

CAR

-

T

产品

ICym

-

riah

和

Yescarta

，分别用于治疗急性淋巴白血病

(acute

lymphoblastic

leukemia

,

ALL

)和非霍奇金淋巴瘤

(

non-hodgkin

lymphoma

,

NHL

)患者，但自体

CAR-T

疗法的广泛应用仍存在着许多限制14]。个性化定制

的方式，不利于工业化生产，患者等待时间漫长，价

格昂贵，难以让更多患者受益。并且，终末期肿瘤患

者经历反复化疗、骨髓移植、乃至自体

CAR

-

T

治疗

复发后，免疫功能低下，其

T

细胞数量和质量均难以

满足体外扩增要求，往往己经丧失自体

CAR

-

T

的治

疗机会。此外，在患者外周血纯化

T

细胞的过程中

若有肿瘤细胞的污染，经慢病毒转导嵌合抗原受体

(chimeric

antigen

receptor

,

CAR

)后，肿瘤细胞也表达

CAR

结构并能通过

CAR

掩盖肿瘤细胞表面的抗原,

使肿瘤细胞发生逃逸[51，导致自体型

CAR

-

T

细胞治

疗失败。

基于自体型

CAR

-

T

疗法所面临的局限和挑战,

通用型

CAR

-

T(universal

CAR

-

T

,

UCAR

-

T

)疗法被寄

予厚望。通用型

CAR

-

T

又称同种异体

CAR

-

T

,是从

健康个体提前采集

T

细胞，并在体外通过基因工程技

术改造后大规模扩增，制备成

CAR

-

T

细胞，可为多名

患者提供现货型的细胞药物，无需等待时间。

移植免疫排斥是通用型

CAR

-

T

细胞治疗的最大障

碍。一方面，供者

T

细胞抗原受体

(T

cell

receptor

,

TCR

)

识别宿主细胞表面人类白细胞抗原

(human

lymphocyte

antigen

,

HLA

)，可引发移植物抗宿主病(

graft

-

versus-host

disease

,

GVHD

)。另一方面，供者

T

细胞表达的

HLA

导致

宿主免疫系统将其识别为非己而被迅速清除[61。同时

敲除供者

T

细胞

TCR

和

HLA

-

I

类分子，从而防止排斥反

应，是制备通用型

CAR

-

T

的关键。

基因编辑技术为制备通用型

CAR

-

T

提供了可

能。簇状规则间隔短回文重复

(clustered

regularly

in

­

terspaced

short

palindromic

repeats

,

CRISPR)/CRISPR

相关基因9(

CRISPR-associated

genes

9,

Cas

9)作为第

三代基因编辑技术，具有设计简单、价格低廉，并且

可添加多个引导

RNA(guide

RNA

,

gRNA

)实现多重

基因编辑等特点。

CRISPR

/

Cas

9的出现使基因编辑

得到广泛应用，未来可实现规模化生产。

CRISPR

/

CaS

9基因编辑技术主要由两部分组成，

gRNA

和

Cas

9核酸酶。

gRNA

识别目的基因的特定

序列与之互补配对，引导

Cas

9核酸酶在目的基因下

游的前间区序列邻近基序

(protospacer

adjacent

mo

­

tif

,

PAM

) 对

DNA

进行定点切割，

DNA

断裂后，启动自

我修复机制，

DNA

在自我修复的过程中优先使用非

同源末端连接

（nonhomologous

end

-

joining

,

NHEJ

)，

错误的插入或缺失碱基，使

DNA

发生突变，实现基

因敲除。

本研究采用

CRISPR

7

Cas

9基因编辑技术敲除

T

细胞的

TCR

和

HLA

-

I

类分子，通过慢病毒将

CAR

转

导入

T

淋巴细胞，制备通用型

CD

19

CAR

-

T

细胞，并

在体外观察免疫排斥反应和肿瘤杀伤能力。本研究

提供了一种构建通用型

CAR

-

T

细胞的途径，有望大

大降低

CAR

-

T

疗法的制造成本，减轻患者治疗负担，

让更多患者受益于

CAR

-

T

疗法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 原代人脐带血

T

细胞来自于成都医学

院第一附属医院，并征得健康志愿捐献者的知情同

意，已通过成都医学院第一附属医院医学伦理委员

会审批，批准号为2018

CYFYHEC

-047-02。经公司

改造的含荧光素酶的

Namalwa

(人

Burkitt

’

s

淋巴瘤细

胞)购于成都飞鸥尔生物科技有限公司；293

T

(人肾

上皮细胞系)购于中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂

PerCP

/

Cy

5.5

anti-human

CD

8、

Alexa

Fluor

®700

anti-human

CD

4

、Brilliant

Violet

711

anti-human

CD

3

、PE

anti-human

HLA

-

A

，

B，C

蒙露等：通用型

CD

19

CAR

-

T

的体外构建及初步功能鉴定

Antibody

和

Biotin

anti-human

HLA

-

A

，

B，C

Anti

­

body

购于美国

Biolegend

公司；

Alexa

Flour

®647

AffiniPure

Goat

Anti-Mouse

lgG

,

F

(

ab

')2

fragment

specigic

购于英国

Jackson

immuno

公司；

CellTrace

™

CFSE(Component

A

)和

DMSO(Component

B

)购于美

国

Thermo

Fisher

Scientific

公司；

LV

载体系统

pLPl

、

pLP

2-

VSVG

和

pLVX

-

CAR

-19购于美国

Thermo

Fish

­

er

Scientific

公司；

Lipofectamine

®3000 转染试剂购于

美国

Thermo

Fisher

Scientific

公司；质粒无内毒素大

提试剂盒购于德国

Qiagen

公司

；HiFi

Cas

9

Nuclease

3

NLS

(

Cas

9蛋白）、

TracrRNA

、

CrRNA

和

gRNA

均

购于美国

roT

公司；

CD

3-

Microbeads

购于德国

MACS

公司

；Pan

T

Cell

Isolation

Kit

购于德国

Miltenyi

公

司

；Dynabeads

Human

T-Activator

CD

3/

CD

28购于美

国

Gibco

公司；高糖

DMEM

和

RPMI

-1640购于美国

Hyclone

公司；胎牛血清购于澳大利亚

BOVOGEN

公

司；

X

-

VIV

015培养基购于瑞士

Lonza

公司；细胞因子

IL

-7、

IL

-15购于德国

Cellgenix

公司；

Lymphoprep

淋

巴分离液购于挪威

Axis

-

shield

公司。

1.1.3

主要仪器

电穿孔仪购于中国

Celetrix

公司；

流式细胞仪购自美国

ACEA

公司。

1.2方法

1.2.1合成靶向

TCR

和

HLA

-

I

类分子的

gRNA

/

f

•列

TRAC-gR^A:

5

f-TGT

GCT

AGA

CAT

GAG

GTC

TA

-31; 77?^

C

-

gRNA

: 5

'-GCA

GTA

TCT

GGA

GTC

ATT

GA

-3f; /?2

A

/-

gRNA

:

S^CGC

GAG

CAC

AGC

TAAGGC

CA

-3，。

1.2.2

分离

T

细胞

使用

Lymphoprep

从脐带血中分

离出单个核细胞，再用

Pan

T

Cell

Isolation

Kit

磁珠纯

化得到

T

细胞。

1.2.3

细胞培养

将

T

细胞在含5

ng/mL

IL

-7、5

ng/mL

IL

-15、10%

FBS

、2

mmol/L

谷氨酰胺和50

mmol/L

p

-

巯基乙醇的

X

-

VIV

015培养基中培养；

Namlwa

细胞

培养于含10%

FBS

的

RPMI

-1640培养基中；293

T

细

胞培养于含10%

FBS

的

DMEM

培养基中。

1.2.4

TCR

和

HLA-I

类分子敲除

T

细胞经过

Dyna

­

beads

Human

T-Activator

CD

3/

CD

28 活化 24

h

后，将

Cas9

蛋白按照

1

:1摩尔比例分别混合77

MC

-

gRNA

、

77?5

C

-

gRNA

和

y

?2

M

-

gRNA

,室温放置 15

min

,合成核

糖核蛋白复合物

(ribonucleoprotein

complex

,

RNP

)» 将

1

Umol/L

77^

C

-

RNP

、1

nmol/L

77?5

C

-

RNP

和 1

nmol/L

沢

M

-

RNP

分别与1

M

06个

T

细胞混合后进行电转，电

313

转条件为电压560

V

,脉冲时间20

ms

进行电穿孔，细

胞铺板培养。96

h

后，用相应流式抗体在4 °

C

染色

10~15

min

,流式细胞仪分别检测细胞表面

TCR

和

hla

-

i

类分子敲除情况。以同样的条件将

RNP

和

y

?2

M

-

RNP

—起与

lxl

〇6个

T

细胞混合后电穿

孔，流式细胞仪检测

TCR

和

HLA

-

I

类分子同时敲除

情况。

1.2.5

纯化

TCR

-

HLA

-

I

__

T

细胞

每1

M

07个目的细

胞加入80

nL

MACS

Buffer

重悬细胞，加入20叫

CD

3-

Microbeads

和20

(iL

Biotin

anti-human

HLA

-

A

，

B，C

Anti

­

body

充分混句, 4

°C

条件下放旋转器上混勾15

min

; 用

10

mL

MACS

Buffer

洗涤多余的磁珠和生物素，去除

上清后加入20

jiL

Pan

T

Cell

MicroBead

Cocktail

, 4

°C

条件下放旋转器上混匀15

min

,再用10

mL

的

MACS

Buffer

洗涤多余的磁珠，去除上清后将细胞用500

pL

MACS

Buffer

重悬后穿过负向分选的

MACS

LD

柱，

回收穿透液，得到纯化的

TCR

和

HLA

-

I

类双敲除细

胞，

S

卩

TCR

HLA-I

T

细胞。

1.2.6

验证同种异体反应活性

以磁珠/细胞0:1、

0

.

5

:

1

、

1:1

和

2:1

分别朿

IJ

激

CFSE

染色的

TCR

-

HLA-r

T

细胞和野生型

T

细胞，

CFSE

是检测细胞增殖的荧光

染料，通过流式检测

T

细胞增殖情况；将

CFSE

染色的

PBMC

细胞分别与

TCR

HLA-r

T

细胞和野生型

T

细

胞以1:5比例混合，观察

PBMC

的增殖情况，以此判断

同种异体反应活性。

1.2.7

慢病毒包装

使用

Lipofectamine

3000试剂

盒制备转染体系，用

P

3000与

pLPl

、

pLP

2、

pLP

-

VSVG

和

pLvx

-

CMV

-

CAR

19四种质粒混合后再与

Lipofectamine

3000混合，再加入适量的

Opti

-

MEM

混

合，室温孵育15~20

min

,将孵育好的混合液滴加到

293

T

细胞中，放入37 °

C

、5%

C

02孵箱中培养，48

h

后收集慢病毒上清液，用0.45

pm

孔径的滤头过滤慢

病毒去除细胞碎片，并用超滤管对慢病毒进行浓缩。

1.2.8

制备通用型

CAR-T

细胞、

CAR-T

细胞和

T

细胞

将

T

细胞用

Dynabeads

Human

T-Activator

CD

3/

CD

28

活化24

h

后，电穿孔递送77?5

C

-

RNP

和沢

M

-

RNP

，电

穿孔96

h

后进行磁珠负向分选，按照一定的感染复数

(multiplicity

of

infection

,

MOI

)往分选后的细胞中加

入慢病毒制备通用型

CAR

-

T

细胞，转导96

h

后用流式

细胞术检测

CAR

阳性率。将

T

细胞活化24

h

后，模拟

电穿孔条件，电穿孔

T

细胞后，在相同的时间和条件

加入慢病毒制备

CAR

-

T

细胞，在同样的时间段检测

314

•研宂论文•

CAR

阳性率。将

T

细胞活化24

h

后，模拟电穿孔条件，

效应

测

TCR

的敲除情况。

TT

^

C

和77

L

4

C

的敲除率分别为

84.0°/。和30.2%(图2

A

),后续实验选择敲除珊

C

•基因

来实现

TCR

分子敲除。通过电穿孔递送

A

2

A/-RNP

进入

T

细胞，96

h

后流式检测

HLA

-

I

类分子的敲除率

为44.0%(图2

B

)。通过同时递送77?5

C

-

RNP

和/?2

A

/-

RNP

不加入慢病毒,制备阴性对照

T

细胞。

1.2.9

通用型

CAR-T

细胞体外杀伤靶细胞

细胞和含荧光素酶的靶细胞

CD

19+

Namalwa

分别以

效靶比 100:1、30:1 和 10:1 混合后，在37 °

C

、5%

C

02

孵箱中共孵育18

h

,每孔加入等体积的荧光素酶底

物，振荡混匀并立即测定其发光情况。发光仪的原

始数据通常以相对光单位

(relative

light

unit

,

RLU

)表

示反应样品中光产生量的相对测试值。杀伤百分比

(%)=(1-靶细胞和效应细胞共培养孔的

RLU

/靶细胞

孔的

RLU)x

100%,杀伤完成后收集杀伤后上清，按照

ELISA

试剂盒说明书检测

IL

-2和

IFN

-

y

表达水平。

进入

T

细胞，双分子敲除率为28.9%(图2

C

)。采

用磁珠对双分子敲除细胞进行负向分选。双敲细

胞比例从分选前28.9%提高到96.5%,得到纯度为

96.5°/。的

TCR

_

HLA

-

I

_

T

细胞(图2

D

)。

2.3

TCR

HLA-I

T

细胞可减弱同种异体反应

为验证

TCR

HLA-I

T

细胞

TCR

功能，以0:1、

0.5:1、1:1和2:1磁珠/细胞分别朿

IJ

激

TCR

HLA

-

I-T

细胞和野生型

T

细胞，用

CFSE

染色观察

T

细胞增殖

情况。结果表明，

TCR

缺失引起

T

细胞对刺激的反应

性降低。结果表明，

TCR

缺失引起

T

细胞对刺激的反

应性降低（图3

A

)。为了验证敲除

HLA

-

I

类分子可以

减弱排斥反应，我们将

TCR

-

HL

A-r

T

和野生型

T

细

胞分别以5:1的效靶比与

CFSE

染色的

PBMC

进行混

合，观察

PBMC

增殖情况。结果表明，

TCR

-

HLA-I

T

1.2.10

数据处理及统计学分析

各实验在相同条

件下重复3次，用

GraphPad

Prism

6统计软件进行数

据分析，数据以均数±标准差(社5)表示，采用

f

检验进

行分析,

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1跻血

T

细胞的纯化与磁珠分选

通过加入

Lymphoprep

去除研血细胞中的大部

分粒细胞得到单个核细胞(图1

A

)。用

Pan

T

Cell

Iso

­

lation

Kit

对

T

细胞进行纯化，用流式抗体对分选前后

的细胞进行染色，得到纯度为98.3%的

T

细胞(图1

B

)。

2.2

TCR

和

HLA-I

类分子敲除与纯化

在体外将

Cas

9蛋白分别与相应基因的

gRNA

以

1:1比例混合后形成

RNP

,通过电穿孑

L

将

RNP

递送进

T

细胞，

gRNA

负责识别特定基因的目标序列，同时

识别

PAM

的

NGG

(

N

代表任意核苷酸)后，对其复合

物携带的

Cas

9蛋白直接进行靶向切割，形成

DNA

双

链缺口

(doubt

strand

breaks

,

DSBs

),启动自我修复机

制

NHEJ

,该过程会随机插入或缺失碱基发生突变,

实现基因敲除。该研究通过电穿孔往

T

细胞中分别

递送77

MC

-

RNP

和7

K

5

C

-

RNP

，96

h

后分别用流式检

(

A

)

" Granulocyte

■c

__________________________ -c __________________________

细胞不能刺激

PBMC

增殖（图3

B

)。以上结果提示，

TCR

HLA-I

T

细胞能减弱同种异体反应。

2.4慢病毒转导

TCR

-

HLA-r

T

细胞和

T

细胞

将

TCR

HLA

-

I

-

T

细胞通过慢病毒转导

CAR

-19,

用流式细胞术检测

CAR

-19转导效率。结果表明，转

导96

h

后，

CAR

阳性率约为68.1%(图4),成功制备通

用型

CAR

-

T

细胞。将模拟电穿孔的

T

细胞以相同条

件进行慢病毒转导，作为后续杀伤对照。结果表明，

CAR

阳性率为66.0%(图4),

CAR

-

T

细胞制备完成，且

电穿孔

RMP

不影响

CAR

-19的阳性率。

2.5通用型

CAR

-

T

细胞体外杀伤靶细胞

经改造的

CD

19+靶细胞

Namalwa

中含有荧光素

酶，加入底物后可催化荧光素发生化学反应产生焚

光。通过检测荧光表达情况，可计算各组靶细胞死

(

B

)

^ Granulocyte

0 »"〇

9

5

8

uss

FSC

9

K

3°〇

CD3

图

1

纯化

T

细胞

Fig.l Purification of T cells

蒙露等:通用型

CD

19

CAR

-

T

的体外构建及初步功能鉴定

315

(

A

)

NoRNP

EP

TRBC-RN?TRAC-KN?

(B)

No RNP

o

l

b

l

b

l

EP

s

u

耆

i.(r

S4.00

,

V

1

H

U

-

ro-

44.0°

A:

流式结果表明，突变

77^

微除效率高于

7V^C; B:

流式结果表明，突变

/?2Af

可使

HLA

-丨类分子敲除；

C:

流式结果表明，在

T

细胞上双敲除

TCR

和

HLA-I

类分子；

D:

磁珠纯化

TCR

和

HLA-I

类分子双阴性

T

细胞。

A: Flow cytometry results show that mutant TRBC knockout efficiency is higher than TRAC; B: Flow cytometry results show that mutant P2M can

knock out HLA-I molecules; C: Flow cytometry results show that TCR is double knocked out on T cells And HLA-I molecules; D: magnetic beads to

purify TCR arid HLA-I molecules double negative T cells.

亡率。通用型

CAR

-

T

细胞、

CAR

-

T

细胞和

T

细胞分

别与

Namalwa

细胞以100:1、30:丨和10:1不同效靶比

混合后，通用型

CAR

-

T

细胞对靶细胞的杀伤率分别

为80.5%、72.7%和65.0%;

CAR

-

T

细胞的杀伤率分

别为94.2%、86.1%和83.6%,而阴性对照

T

细胞的杀

伤率仅有42.4%、30.2%和17.7%,显著低于通用型

CAR

-

T

细胞和

CAR

-

T

杀伤后细胞培养上清，采用

ELISA

检测细胞因子

IL

-2

和

IFN

-丫释放情况。通用型

CAR

-

T

细胞和

CAR

-

T

细

胞的

IL

-2和

IFN

-丫分泌水平均显著高于正常

T

细胞

(

P

<0.001,图5

B

),结果表明，通用型

CAR

-

T

细胞能

特异性杀伤

CD

19+肿瘤细胞。

3讨论

自体型

C

AR

-

T

细胞疗法受限于患者

T

细胞的数

量和质量，尤其是对新生儿和老年患者，以及经过

多次放化疗的患者，常常无法制备足够数量的功能

性

T

细胞

m

。此外，采用个体化制备的自体型

CAR-T

细胞治疗费用昂贵。诺华的

Kymriah

售价47.5万美

元，〇丨^(1的丫6303113售价37.3万美元，极大限制了其

所能受益的患者群体。制备通用型

CAR

-

T

细胞成为

.

V

1

H

CD3 CD3

图

2 TCR

和

HLA-I

类分子敲除与纯化

Fig.2 Knockout and purification of TCR and HLA-I molecules

CAR

-

T

领域的重要研宄方向。

本文首先分离出脐带血来源的单个核细胞后分

选纯化

T

细胞。其次，将

T

细胞进行基因改造，敲除供

者

T

细胞的

TCR

和

HLA-I

类分子使其能规避移植后的

免疫排斥反应。

TCR

是由

a

和

p

两条不同肽链构成的

异二聚体，分别由和77

JSC

基因表达。基因突

变77

L

4

C

或77?

SC

均能实现

TCR

敲除。由于

P

链含有两

个恒定区，《链恒定区基因只有一个，因此，大部分研

宄者通过敲除编码基因的恒定区来敲除

TCR

[81，

并且敲除77

L

4

C

基因效率高于77故(^|()1。然而，本研

宄发现，77^

C

的敲除效率远远高于77

MC

,因此，后

续实验均选择突变基因来实现

TCR

的敲除。

细胞(

P

<0.000 1,图5

A

)。收集

HLA-I

类分子由

P-2

微球蛋白

（

beta-2-microglobins,

(32M)

亚基与重链组成。卩

2M

是所有

HLA-I

类抗原异

二聚体在细胞表面表达的必需亚基，对

HLA

-丨

类分

子的表达至关重要本研究通过同时敲除

和

A

2

A

/基因来实现

TCR

和

HLA-I

类分子的双敲除。

己有研宄者利用基因编辑工具制备通用型

CAR

-

T

细胞。如

TORIKAI

等(

和

HLA

-

A

1131。但

ZFN

设计繁琐，高度依赖目

酶

(zinc

finger

nuclease

,

ZFN

)在

CAR

-

T

细胞中敲除

316

•研宂论文•

(

A

:

Bead: cell

.7

°〇

0*

Vt

6.

C

2

l

.5°〇

K

WT

5

j

丨

10'

〇

4oI

10， 10- 10 • 10'

I

4o

l(r

OOZOSI

001

O

S

0

’

TCR_HLA-I T

10' 106 10'' 10，

4ol

CFSE

01'

l(r

(B)

PBMC

5

o

o

i

00:

0

c

n

o

o

PBMC alone

WT^PBMC

32.8%

0K091

TCR Hl.A-l T+PBMC

，

3.7

°〇

, ,

I

J

,

I

I

_______

L

’

0

,

y':

A:

流式结果表明，

TCR

敲除的

T

细胞不能被磁珠刺激活化

;B:

流式结果表明，

HLA-

丨类分子敲除后不能刺激

PBMC

增殖。

A: Flow cytometry results show that TCR knockout T cells cannot be activated by magnetic beads; B: Flow cytometry results show that knockout

HLA-I molecules cannot stimulate PBMC proliferation.

图

3 TCR HLA-I-T

细胞可减弱同种异体反应

Fig.3 TCR' HLA-I~ T cells can attenuate allogeneic responses

CAR-19

O

X

yj

ia

*

io

»

CFSE

io

io

■

10' 10' 1

(T

10' 10-

b

l

b

l

>

0

1

6

S

V

U

i

6.0

fe

l

0

V

)

1

FSC

图

4

慢病毒转导

TCR-HLA-rT

细胞和

T

细胞

Fig.4 Lentiviral transduction of TCR HLA-r T cells and T cells

蒙露等:通用型

CD

19

CAR

-

T

的体外构建及初步功能鉴定

317

(

A

)

CAR-T f„20 000

L

(

B

)

210

〇〇〇

E:T ratio

A:

通用型

CAR-T

细胞能特异性杀伤靶细胞；

B:

通用型

CAR-T

细胞杀伤时释放的

IL-2

和

IFN-

y

均高于

T

细胞。

n.s.: P>0.05

。

***P<0.001; ****

尸

<0.000 1; n.s.: P>0.05.

“♦/^; ““/^ 1;

A: universal CAR-T cells can specifically kill target cells; B: universal CAR-T cells release more IL-2 and IFN-y than T cells during killing. n=3

图

5

通用型

CAR-T

细胞体外杀伤靶细胞

Fig.5 Universal CAR-T cells kill target cells

in vitro

标序列及其上下游序列，还具有细胞毒性并且无法

实现多重基因敲除。

Cellectis

的研宄人员采用类转

录激活效应物核酸内切酶

(transcription

activator-like

effector

nuclease

,

TALEN

)敲除

T

细胞的77

MC

(natural

killer

,

NIC

)细胞，以避免或减少排斥反应。此

外，通过

CRISPR

/

Cas

9敲除

NK

细胞激活性配体或在

T

细胞上表达特定的非多态性

HLA

E

，提供抑制信号，可使

NK

类分子，如

HLA

-

和

C

£>52

介导的宿主抗移植物反应

生产通用型

CAR

-

T

细胞⑷。然而，该方法基因编辑

效率低，导致产品产量低，生产过程时间长，不利于

大批量工业生产。

CRISPR

7

Cas

9系统具有操作简单、

价格低廉、可同时实现多重基因敲除等优点。另外，

gRNA

最小化

本文采用基于

RNP

形式的

CRISPR

/

Cas

9基因

编辑技术同时敲除

TCR

和

HLA

-

I

类分子制备通用型

CAR

-

T

细胞，可在体外实验中显著减弱排斥反应并

的设计和合成工作量远远小于

TALEN

和

ZFN

保持杀伤能力，但仍需要在动物实验中验证其抗肿

瘤能力、安全性和可行性。未来可在本文提供的通

用型

CAR

-

T

细胞制备流程基础上进一步改造，制备

具有更强增殖能力和抗肿瘤活性的通用型

CAR

-

T

细

胞，为更多患者提供治疗机会。

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技术，使得

CRISPR

/

Cas

9技术得到广泛使用。

目前，递送

CRISPR

/

Cas

9基因编辑系统的非病

毒载体有三种。一是基于质粒的

CRISPR

系统，采用

同一载体编码

Cas

9蛋白和

gRNA

,可避免不同成分的

多次转染[141,且成本低、稳定性较好。但质粒

DNA

对原代

T

细胞的高毒性，是应用的一大难题

M

。二是

mRNA

形式的

CRISPR

系统，基因编辑时间快，但

不稳定，基因编辑效率低，需要多次递

mRNA

送才能达到较高的敲除效率并且对细胞损害较

大，操作繁琐。三是递送

RNP

形式的

CRISPR

系统【17]，

具有快速作用，基因编辑效率高，没有密码子优化和

启动子选择的要求，且细胞毒性较低等优点。本研

宂选择递送

RNP

形式的

CRISPR

系统进行双基因敲

除，取得了良好的基因编辑效果。

通用型

CAR

-

T

细胞回输体内后，由于

HLA

-

I

类

分子缺失，患者体内

NK

细胞通过

HLA

-

I

类分子来识

别“自体和非自体”并对识别的“非自体”细胞进行攻

击，导致通用型

CAR

-

T

的清除，缩短了

CAR

-

T

在患者

体内存活时间短。有文献报道通过化疗药物或使

用

NK

细胞特异性抗体减少患者体内自然杀伤

318

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本文标签： 细胞基因敲除制备患者