细胞培养实战经验分享，全面指导，成为细胞培养高手

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细胞培养实战经验分享，全面指导，成为细胞培养高手

细胞不仅是生物实验的重要材料，也是生物细胞实验的基础。大多数关于药物、基因功能和疾病机制的研究都需要在细胞水平上进行解释。然而，细胞培养受人员操作和环境条件的影响很大。细胞培养中经常会遇到很多细节问题，每个问题都可能导致细胞培养失败。本文总结了细胞实验室多年来的细胞培养经验与大家分享，希望对大家的细胞培养有所帮助。

1.细胞系的身份需要明确。

由于所选细胞系的某些特性符合研究方向的设定，因此我们选择了某一细胞系进行实验。例如组织特征、疾病特征、功能特征、基因表达特征等。一旦使用了错误的细胞株，对我们研究结果的判断就会产生很大的误差和不确定性。

近几年来，许多权威机构发现，在细胞系的培养和流通过程中，存在着严重的交叉污染。据不完全统计，仅仅因为Hela细胞系统造成的污染就导致了3万多篇论文结果的准确性，而这种情况并不局限于Hela细胞。许多权威机构的研究人员发现，超过451个细胞系统已被其他细胞完全吸收，46%的细胞污染被检测到。可以看出，细胞交叉污染非常普遍。所以，在做实验之前，验证细胞株的正身是非常重要的。若是在机构内购买的细胞株，最好让供应商提供合格的STR鉴定报告。

目前，STR基因分类法是细胞交叉污染和性质鉴定最有效、最准确的方法之一，是ATCC等权威机构认可的黄金标准。不幸的是，并非所有细胞都可以通过STR进行识别。目前，只有大多数人类细胞株和45种小鼠细胞株可以进行识别。其它细胞株可结合细胞形态、特性和物种鉴定进行确认。

二、培养、传代、冻存和复苏。

1.准备工作：

根据培养细胞的特性，提前准备适当的培养基和血清。为了避免细胞在新环境下需要过渡适应，最好遵循细胞原有的培养条件。与此同时，充分了解细胞的生长特性和形态特性，便于后续的培养观察。

2.贴壁细胞的传代：

1)移除使用过的细胞培养液。(不要直接倒出，以免造成瓶口残留物污染)

2)用平衡盐溶液(PBS)冲洗细胞，不含钙镁离子。轻轻地将冲洗液从与壁细胞层相对的容器一侧加入，以免搅动细胞层，前后摇动容器数次，最后将冲洗液移除。(洗掉残留的血清，避免影响胰酶的活性。)

3）以25cm2的培养瓶为例，在瓶中加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据每个细胞的指导使用适当的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液在所有细胞表面流动，并在37℃下孵化。通常，在几分钟内，细胞质量会收缩，细胞间隙会增加。倾斜培养瓶时，细胞层可以自然流下。此时，应添加含有2-3ml血清的完整培养液，以终止消化（请参考每个细胞的指导方针进行细胞分离所需的时间，建议每30秒在显微镜下观察细胞分离）。此外，并非所有贴壁细胞都适合使用胰蛋白酶进行解离，请根据每个细胞的指导选择合适的解离方法。

4）倾斜培养瓶，吸收培养瓶中的液体，轻轻地冲向原细胞生长表面，重复这个动作2-3次，使所有细胞沿着瓶底流下，然后轻轻地将细胞吹成单个悬浮液（吹气过程中应避免气泡）。

PS：对难以消化的细胞，尽量不要用力吹打来处理，以免对细胞造成物理损伤。先将消化后的细胞分离出来，及时停止消化。然后再次消化仍然靠近墙壁的细胞。实现分层消化，避免胰酶消化下易消化细胞长期受损。

5)将所有细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移除上清。

6)加入新的含血清完全培养液，重新悬挂成单细胞悬液。按照各种细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到各种培养器皿中，补充新的含血清完全培养液，轻轻摇匀。

7)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞的贴壁情况。

3.悬浮细胞的传代：

由于悬浮生长细胞不靠近墙壁，因此在传代过程中不需要使用酶消化法，而是可以直接传代或离心收集细胞后传代。

1）直接传代时，静置5-10分钟。悬浮细胞慢慢沉淀到容器底部后，吸收1/2-2/3的原始培养液，补充新鲜含血清的完整培养液，混合成细胞悬浮液。按照每个细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到每个培养器皿中，轻轻摇匀。

2)离心传代时，将细胞和培养液一起转移到离心管内，离心时间为800-1000rpm3-5分钟。去除上清后，加入新鲜的含血清完全培养液。按照各种细胞指引推荐的传代比例，将细胞悬液均匀地分配到各种培养器皿中，补充新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇匀。

3)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞状况。

4.壁挂式悬浮混合细胞的传代：

首先收集悬浮细胞，然后参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种培养器皿。

PS：在悬浮细胞生长过程中，对细胞密度的要求一般较高，在培养过程中最好参考指南来控制细胞密度，不能过密或过稀。

5.细胞冻结：

1)按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。

2）加入细胞冷冻储存液（一般为10%DMSO+相应细胞的完整培养液），使细胞的最终密度为（5~10）×105/ml，并将其移入细胞冷冻储存管。

3)程序冷却(以需要异丙醇的Nalgene程序冷却盒为例)：4℃30min→-80℃过夜→液氮。(4℃30min一定不能省略，否则冻存液不能渗透到细胞中，容易产生冰晶，造成细胞损伤。)

6.细胞复苏：

1）取出储存的细胞。液氮挥发后，立即在37℃的水浴中轻轻摇动以快速融化（通常在2分钟内，细胞状态会随着时间的推移而受到影响）。为了避免冻存管因温差剧烈变化而爆裂，操作此步骤时请戴上防护面罩或防护目镜。

PS：冷冻细胞用干冰运输，收到后需立即放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。

2)转移到无菌控制台，用75%酒精擦拭冷冻存管外部。

3)将细胞悬液转移到含血清完全培养液离心管中，含血清预热10-20ml，800-1000rpm离心3-5分钟，将上清移除。

4)将含血清完全培养液重悬细胞重新加入预热后，以约(3~5)×105/ml密度接种到培养器皿中。

5)放入37℃孵化，第二天在显微镜下观察细胞状况。

三、污染防治。

1.细菌污染。

细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要是由于操作不慎或使用消毒不完全的耗材和试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌和白葡萄球菌。镜下形状为长杆状、短杆状、颗粒状等。

左边是比较典型的杆菌污染，一般杆菌会延轴快速游动，量少时培养基会澄清。右边的图片是颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白沙沉淀。

好氧细菌迅速增殖和分裂，培养基可在感染后24小时内浑浊；厌氧细菌在常规细胞培养条件下缓慢增殖，观察浑浊需要很长时间。

污染处理：由于抗生素在国内细胞培养中的广泛使用，污染后添加双抗体（青霉素和链霉素、Penicillin+Streptomycin）通常无效。杆菌可以用100ug/ml庆大霉素治疗一周，颗粒状细菌可以用25ug/ml环丙沙星治疗一周，效果比较好。

2.真菌污染。

烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白念珠菌、酵母菌等是细胞培养中最常见的污染真菌。

左边的图片是典型的霉菌污染图片，右边的图片是酵母污染，镜子下可以看到明显的发芽形态。

污染处理：可使用100ug两性霉素B/T25瓶，治疗一周。

注意：两性霉素毒性较大，需要在细胞超过50%且状态没有受到很大影响之前进行治疗。

3.支原体污染。

支原体的危害：支原体污染能改变细胞的特性。例如，一些支原体会迅速消耗培养液中的精氨酸，并与细胞竞争营养，从而减缓或停止细胞的生长；同时，支原体还可以改变细胞的酶谱和细胞膜成分，导致细胞染色体异常或细胞病理变化。上述情况会严重影响使用这些细胞进行实验的结果，导致结论不可靠。

(PCR法检测细胞上清中的支原体污染)

支原体的预防和清除：由于支原体不能直接在镜子下看到，因此需要通过PCR方法进行检测，因此污染后很难找到。建议每月对养细胞进行一次检测，并结合每周抽样检测，以便早期发现污染。对正在进行支原体去除处理的细胞，建议每周进行一次必要的检查，直到出现阴性结果，并至少维持一个月。对不同细胞进行分离处理，优先对“支原体阴性”细胞进行处理，然后对受感染的细胞进行去除处理。与此同时，所有新引进的细胞系都进行了支原体检测，以确保实验室没有新的污染。

4.预防和控制实验室细胞污染。

建立良好的规章制度对减少细胞污染有很大帮助。包括准入系统、操作规范和日常管理系统。

访问系统：包括人员和材料。人员在进入实验室前需要进行培训，并且必须符合穿着要求，如白大褂、隔离服、口罩、手套等。而且所需的物品，非一次性物品要严格消毒灭菌，而购买的物品要从正规、可靠的渠道购买。新购买的细胞在使用前应进行检测和验证。

操作规范：最好制定常规操作规范，实验室人员应遵循操作规范，不得随意更改。同时，也是培养实验人员良好的操作习惯。例如，枪头滴管吸入后，不再再次伸入培养基中吸入，一次吸入足够量的培养基。在加液时也要尽量做到悬空加液，这样可以有效地防止支原体污染和细胞交叉污染。此外，如果可能的话，一次只能操作一个细胞，最好在细胞和细胞之间有一点时间间隔，以避免交叉污染。

日常管理制度：包括使用、清洁、维护等各方面的规则、方法，如环境和耗材试剂。还有试剂耗材等的消耗、库存和采购管理，包括细胞样品的二级库存管理。对难以发现的污染源，最好定期检测，主要是支原体污染和细胞交叉污染。

四、总结细胞培养中常见的问题。

新购买或赠送的细胞。

1.如何处理新购买或赠送的细胞？

无论你购买的细胞还是礼物的细胞，当你第一次得到它们时，你都应该迅速做这些事情：检查瓶子是否破裂；培养基是否泄漏，是否浑浊；是否有支原体污染；快速扩大冷冻储存。

2.是否可以使用与原培养条件不同的培养基？

没有。每个细胞株都有自己的特定使用和适应的细胞培养基。如果突然使用不同于原始培养条件的培养基，大多数细胞无法立即适应，导致细胞无法生存。

3.购买的细胞死亡或存活率差的可能原因？

常见原因可能有：培养基使用不当或培养基质量差；血清使用不当或血清质量差；解冻过程中的错误；冷冻细胞解冻后，清洗细胞并离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用不当；培养箱的气体浓度不能满足要求；细胞在-80℃下放置时间过长。

恢复冷冻细胞。

4.为什么收到的冷冻管瓶体破裂，瓶盖有裂纹，或者瓶盖脱落？

冷冻管瓶盖开裂或瓶体开裂可能是由于操作人员夹紧冷冻管时用力不当造成的，导致冷冻管开裂。建议使用止血钳仔细夹紧。此外，冷冻管瓶盖松动或松动是由于热膨胀和冷收缩造成的物理现象。冷冻管可能会造成细胞污染。因此，当放入和取出液氮桶时，冷冻管应立即再次拧紧。

5.冷冻管应该如何解冻？

将冷冻管从液氮桶中取出解冻时，一定要注意安全，戴上防护眼镜和手套，防止冷冻管爆裂。取出冷冻管后，应立即放入37℃的水浴环境中快速解冻。轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内完全融化，以避免水渗入细胞，形成细胞内的再结晶，对细胞造成损害。并且注意水面不能超过冷冻管盖的边缘，否则容易发生污染。

6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应立即去除DMSO？

目前，大多数实验室将在解冻细胞后添加培养液来去除DMSO。然而，一些研究人员认为，除了少数特别注明对DMSO敏感的细胞外，大多数细胞株（包括悬浮细胞）可以直接放入含有10~15毫升新鲜培养基的培养角瓶中，第二天更换新鲜培养基以去除DMSO，以避免解冻后大多数细胞无法生长或附着的问题。