Cancer Cell

Cancer Cell"/>

Cancer Cell

肿瘤微生物组与胰腺癌细胞程序和免疫之间的联系

Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer

Article, 2023-10-10, Cancer Cell, [IF 50.3]

DOI：10.1016/jell.2022.09.009

原文链接：

第一作者：Bassel Ghaddar, Antara Biswas

通讯作者：Martin J. Blaser, Subhajyoti De

合作作者：Chris Harris, M. Bishr Omary, Darren R. Carpizo

主要单位：

罗格斯大学新泽西州罗格斯肿瘤研究所系统与计算生物学中心（Center for Systems and Computational Biology, Rutgers Cancer Institute of New Jersey, Rutgers University）

罗切斯特大学医学中心外科系（Department of Surgery, University of Rochester Medical Center）

罗格斯大学高级生物技术与医学中心（Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Rutgers University）

- 摘要 -

微生物在多种癌症类型中被检测到，甚至在被认为是无菌器官的情况下也是如此，但它们在影响人类肿瘤发生或抗肿瘤反应的背景仍然不清楚。我们最近开发了宿主-微生物相互作用的单细胞分析（SAHMI），这是一个计算流程，用于从宿主组织的单细胞测序中恢复和去噪微生物信号。在这里，我们使用SAHMI来研究两个人类胰腺癌队列中的肿瘤-微生物相互作用。我们在一部分肿瘤中识别出与体细胞相关的细菌，在非恶性组织中几乎没有它们。这些细菌主要以肿瘤细胞为宿主细胞，其存在与细胞类型特异性的基因表达和通路活性有关（包括细胞运动和免疫应答）。建模结果表明，肿瘤浸润淋巴细胞与感染组织中的T细胞非常相似。最后，使用多个独立的数据集，一个与细胞相关的细菌特征能够预测临床预后。肿瘤-微生物组的相互作用可能会调节胰腺癌的肿瘤发生，对临床治疗具有重要意义。

图形摘要

- 引言 -

微生物组对人类健康和疾病和疾病有着重要影响，包括肿瘤的发生发展。尽管目前尚不确定健康的胰腺是否具有自己的微生物组，越来越多的证据表明，细菌和真菌可以转移到胰腺并诱导局部和全身性变化，从而促进胰腺导管腺癌（PDA）的发展。微生物产物改变基因调控，导致DNA损伤，刺激模式识别受体，增强突变的KRAS信号传导，并诱导炎症和免疫抑制。PDA中的微生物群体也可能对治疗产生耐药性，包括通过微生物胞苷脱氨酶失活胞苷，以及抗生素引起的肠道微生物群减少可能会增加对免疫检查点抑制剂的敏感性。长期存活的PDA患者的肿瘤携带的微生物群也越来越多样化，而且出现了与微生物肽有同源性的肿瘤新抗原。

尽管在胰腺癌中的作用越来越明显，但有几个障碍限制了对患有PDA的个体中与肿瘤相关微生物组的系统研究。首先，许多肠道微生物很难培养。其次，微生物组成可以在个体之间有很大差异，而且很少有模型系统能够充分再现人体中的肿瘤-微生物相互作用。第三，手术后可能发生样本污染，使数据解释复杂化。最近的研究在癌症基因组图谱（TCGA）中发现了癌症特异的微生物标志物，并且通过对数百个原始人类肿瘤进行16S细菌核糖体DNA测序（16S-rDNA-seq）分析，发现了肿瘤特异的细胞内细菌。然而，这些研究分析了来自大块组织样本的基因组数据，这些数据未能捕捉到微生物-体细胞富集、与细胞类型特异性活动的相关性，以及微生物对细胞间通信网络的贡献。特别是，PDA的特点是由肿瘤体积的大部分组成的纤维化基质，通过大块分析来解开细胞之间的关系是困难的。在这里，我们使用SAHMI（宿主-微生物相互作用的单细胞分析）来以基因组方法在单细胞分辨率下研究胰腺癌中的肿瘤-微生物关系。

- 结果 -

1. 检测和验证单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中的宏基因组读序

Detection and validation of metagenomic reads in scRNA-seq data

我们最近开发了SAHMI，这是一个系统性的流程，用于在人类临床组织中系统地恢复和去噪微生物信号，并在单细胞分辨率下评估宿主-微生物相互作用（图1A；STAR方法）。简要地说，SAHMI首先使用基于k-mer的分类学分析器Kraken2Uniq将单细胞RNA测序（scRNA-seq）读序同时映射到宿主（例如人类）和参考微生物基因组，以鉴定真实的微生物读序。接下来，一系列的过滤器会删除质量较低的读序和分配。如先前在已知感染样本上展示的，SAHMI通过分析在单个样本中的scRNA-seq条形码以及在研究中的多个样本之间的每个分类单位分配的总数和唯一k-mer之间的关系来鉴定真实的微生物读序，我们称之为k-mer相关性检验（kCT）。通过比较个体分类单位计数与在负对照样本中的分布，使用分位数检验来鉴定误报的分类分配和污染物，为此SAHMI提供了一个广泛的无菌细胞系微生物组参考数据集，可在没有匹配对照样本的情况下使用（细胞系分位数检验[CLQT]）。然后，可以将去噪的微生物配置文件与宿主细胞转录组一起进行联合分析，并且可以将微生物与共享相同scRNA-seq细胞条形码的个体体细胞配对。因此，SAHMI能够在单细胞分辨率下对宿主-微生物生态系统进行系统分析。

图1 PDA微生物组的检测和验证

（A）研究设计。另见表S1。scRNA-seq，单细胞RNA测序；kCT，k-mer相关性检验；CLQT，细胞系分位数检验。

（B）散点图显示使用不同技术测序的胰腺肿瘤的微生物属和物种计数的相关性。蓝色虚线，最佳拟合线；Spearman相关性检验；WGS，全基因组测序。

（C）堆叠条形图显示由SAHMI对scPDA1-2中的读序进行的分类。

（D）散点图显示在scPDA1和scPDA2中检测到的所有物种的kCT。每个点代表一个物种。x轴，物种在样本间分配给给定物种的总k-mer数量与唯一k-mer数量之间的Spearman相关性值；y轴，物种在条形码间分配给给定物种的总k-mer数量与唯一k-mer数量之间的Spearman相关性值。真实物种在两个测量中都具有显著的相关性。

（E）示例归一化计数密度图，比较在scPDA1和scPDA2中检测到的部分物种每百万读序与作为负对照的成千上万次细胞系实验中检测到的相同物种。左侧的三个图是在污染和噪声阈值之上检测到的物种。右侧的三个图是污染物。

（F）叠加直方图，显示在scPDA1和scPDA2中解析到物种级别的读序的基因组映射位置，显示读序映射到各自基因组的各个位置。每种颜色代表一个物种。每个物种的映射位置进行了缩放。另见图S1B。

（G）箱线图，比较所有读序与微生物组读序可映射到人类基因组的百分比。点代表异常值；Wilcoxon检验。

（H）条形图，指示在scPDA1和scPDA2中鉴定的属的体部位富集分数。

（I）热图，显示来自多个研究和测序技术的胰腺肿瘤中细菌属计数的Spearman相关系数。RNA-seq (14)和16S-rDNA-seq (14)，14个在实验室内用总RNA-seq和16S-rDNA-seq测序的样本；WGS (4)和scRNA-seq (4)，4个在实验室内用单细胞RNA和WGS对样本进行定量；16S，Nejman等人（2020）的胰腺肿瘤；TCGA，Poore等人（2020）的胰腺肿瘤。

（J）箱线图，显示将scPDA1和scPDA2中的属与其他PDA研究（绿色）或其他组织类型和疾病（蓝色）中的属进行比较的重叠系数。箱线图与（G）中的相同；Wilcoxon检验。

在这里，我们展示了在PDA中以单细胞分辨率研究宿主-微生物相互作用的SAHMI的实用性。首先，我们想确定是否可以使用scRNA-seq在人类PDA肿瘤中检测到微生物序列，以及它们的配置与不同测序方法的比较。我们通过scRNA-seq和全基因组测序（WGS）分析了4个肿瘤，以及通过RNA-seq和16S-rDNA-seq分析了14个肿瘤和正常邻近组织。在所有样本中都检测到了细菌，并且使用这两种测序技术测得的配置之间存在显著的相关性（Spearman相关系数，p < 2.2e-16；图1B）。

接下来，我们将SAHMI应用于两个大型独立的scRNA-seq PDA队列，分别称为scPDA1和scPDA2。这两者合并包括41个PDA肿瘤样本和14个正常胰腺组织样本（表S1）。正常样本来自于接受胰腺手术但未患恶性胰腺肿瘤的个体。在每个队列中，所有样本都经过类似的处理，当使用统一流形逼近和投影（UMAP）对数据进行聚类时，我们观察到样本之间没有批次效应（图S1A），减轻了不同研究中的差异污染的担忧。这些胰腺组织每个样本有100-1500亿的总测序读序；平均而言，Kraken2Uniq将94%的读序分类为人类（SD = 4%），4%为未分类（SD = 3%），并且将0.6%分辨为微生物属水平（SD = 0.2%），涵盖了1962个属和7236个物种（图1C）。

我们采用了多个基准和验证步骤来去噪数据，并确保我们的最终观察结果不是由于人为因素或污染引起的。首先，采用SAHMI的kCT方法，它通过读序数量与条形码和样本之间的总和唯一k-mer数量之间的相关性来鉴定真实的分类单元。我们观察到广泛的相关性值范围（图1D），只有少数分类单元（9198个中的2565个[28%]）在所有相关性中满足显著性标准。

其次，考虑到缺乏物理负对照样本，我们应用了SAHMI的CLQT方法来鉴定可能的误报的分类分配和污染物种。该检验将分类单位频率与在世界各地数千个无菌RNA-seq运行中找到的分布进行比较，涉及来自正常和疾病组织的1000多个人类细胞系的1000多个细胞系。CLQT清楚地将scPDA1和scPDA2中的38个分类单元在噪声阈值之上进行了区分，并鉴定了数据中的污染物（图S1B）。显著的分类单元，如胃肠道物种Campylobacter concisus、Clostridioides difficile和Fusobacterium nucleatum，在参考数据集中的微生物频率大于95th百分位数，而大多数分类单元，包括常见的污染物如Mycoplasma orale、Ralstonia picketti和Staphylococcus epidermidis，检测到与细胞系数据一致的水平（图1E）。因此，只有少数读序（平均0.01%）和分类单元（平均2%）通过了所有SAHMI去噪标准，并用于进一步的分析（有关详细信息，请参阅STAR方法；图1C）。作为额外的措施，我们检查了最近识别的常见污染物的数据；419个报告的污染物属中的229个最初被检测到，但没有一个通过了我们的过滤措施。因此，这些去噪步骤鉴定出了在scPDA1和scPDA2中高于随机期望频率存在的分类单元，并且这些分类单元中存在着多样的RNA。

第三，我们通过使用经过验证的RNA-seq比对工具来对解析到物种级别的分类单元进行读序验证。对于每个物种，我们提取其读序并将其与参考基因组进行比对。在所有样本和物种中，超过90%的读序映射到基因组中的各个位置（STAR方法）。映射的读序并未仅偏向特定区域，这表明它们不是人为因素（图1F和图S1C）。虽然某些映射位置过多，但映射模式与以前通过scRNA-seq分析的临床组织中验证过的病原体的模式一致。

第四，尽管我们在初始的分类学分析步骤中排除了人类读序，但我们尝试使用第三个比对算法将去噪的微生物读序映射到人类转录组。在每个物种中，只有2.5%（中位数）的SAHMI微生物读序可映射到人类转录组；这显著低于在包括所有读序时整体样本的映射率（Wilcoxon p < 2e-16；图1G），表明SAHMI富集了非人类读序。

第五，为了评估PDA微生物组的可能生态来源是否如预期，我们使用mBodyMap（方法）计算了scPDA属的体部位富集分数，mBodyMap是一个包含超过22个体部位的60000多个测序结果的人工校正过的人类微生物组数据库。scPDA分类单元的生态来源主要是胃肠道（GI）中各个器官，此外还包括在呼吸道或血液中发现的微生物（Wilcoxon p < 2e-16；图1H）。考虑到胰腺通过胰腺导管与胃肠道直接接触（并且呼吸道微生物也会被摄入），这些结果是可以预期的，并且与将GI细菌与胰腺疾病联系起来的文献一致。

第六，我们将scPDA1和scPDA2中的微生物配置与使用其他技术分析的PDA微生物配置进行了比较。这些包括（1）我们用双重scRNA-seq和WGS对4个肿瘤进行定量，（2）我们用双重16S-rDNA-seq和RNA-seq对7个肿瘤和7个相邻正常胰腺组织进行了定量，（3）TCGA中的PDA的RNA-seq（Poore等，2020），以及（4）近期大规模研究中的PDA的16S-rDNA-seq数据（Nejman等，2020），总共327个用四种不同技术进行测序的胰腺样本。我们对所有研究中分配给每个属的读序（或归一化计数）进行了相关性分析，发现scRNA-seq和其他技术之间存在显著的一致性（图1I）。特别是，scRNA-seq数据之间的相关性非常显著（平均Spearman r = 0.78，平均p = 1e-5），表明scRNA-seq的配置是可重复的，scRNA-seq和16S-rDNA数据之间的相关性与RNA-seq和16S-rDNA之间的相关性相当，这表明scRNA-seq与批量RNA-seq相比在读序捕获方面没有引入显著的偏差。这些与阳性对照的比较表明，SAHMI定量地识别了scPDA中相关的分类单元。

第七，我们使用SAHMI分析了不太可能具有主要下消化道微生物组的不同scRNA-seq样本，这些样本可以作为阴性对照，并将其检测到的微生物与scPDA1和scPDA2中的微生物进行了比较。我们分析了来自新冠病毒疾病患者的支气管肺泡灌洗液数据，麻风病患者的皮肤样本，幽门螺旋杆菌感染个体的胃上皮组织数据，以及感染了单核细胞的单核细胞的外周血液数据。在每项研究中，SAHMI都在感染样本中鉴定出已知的病原体，并在对照组中没有检测到。接下来，我们计算了scPDA与其他PDA微生物组研究之间的微生物分类单元重叠，并将其与scPDA与这些阴性对照样本之间的分类单元重叠进行了比较。如预期，尽管使用不同的技术对其进行定量，scPDA与PDA数据之间的分类单元重叠显著大于（Wilcoxon p = 0.029）scPDA与阴性对照样本之间的分类单元重叠（图1J）。与PDA数据的平均重叠系数为0.67。相比之下，与感染研究中的scPDA重叠的唯一分类单元是Clostridium和H. pylori，两者都来自胃样本。这些结果验证了SAHMI识别出正确的组织存在的分类单元的能力。

这些基准检验和验证分析表明，我们通过scRNA-seq在PDA中鉴定出的微生物组与近期文献一致。特定的微生物读序在其各自的基因组中分布，并且其存在频率大于预期的污染水平。SAHMI在PDA中鉴定出了生态相关的分类单元，这些分类单元在其他组织和疾病状态的分类单元中几乎没有重叠。

2. 细胞相关的细菌存在于部分胰腺肿瘤中

Cell-associated bacteria are present in a subset of pancreatic tumors

在所有数据处理步骤之后（详见STAR方法），我们检测了55份受试胰腺样本中的48份（87%）的微生物读序，并确定了scPDA1和scPDA2中均存在的19个细菌属。这些属平均有29498个独特的k-mer序列（范围为1010-210105；图2A）。测序深度是宏基因组学中常见的混淆因素；然而，在数据去噪后，体细胞和微生物基因计数之间没有相关性（Spearman scPDA1，p = 0.11，scPDA2，p = 0.82；图S2A）。

图2 一部分肿瘤具有细胞相关的细菌

（A）箱线图显示在scPDA1和scPDA2中检测到的每个属分配的独特k-mer数量。

（B）箱线图（上，scPDA1；下，scPDA2）比较T（肿瘤）样本与N（正常）样本中每个样本的细菌计数总数。

（C）在scPDA1和scPDA2中的细胞相关细菌计数表。堆叠条形图显示每个样本的计数和属组成。K表示千。

（D）用于scPDA1（57530个细胞）和scPDA2（59473个细胞）的UMAP（均匀流形逼近和投影）图。通过细菌共享条形码的细胞被标记为黄色（scPDA1）或绿色（scPDA2）。

（E）在scPDA1和scPDA2中，每个细胞类型与细菌相关的细菌计数的条形图。

（F）使用Wilcoxon检验在单个条形码级别鉴定的显著（p < 5e-3）细菌细胞类型富集的Circos图，同时在scPDA1和scPDA2中共享。带宽与富集强度相关。

（G）条形图显示每个细胞类型的细菌相关细胞与未关联细胞之间的转录多样性的调整后的Wilcoxon p值。

在96135 (scPDA1)和479834 (scPDA2)分子条形码上检测到微生物读序，与正常样品相比，肿瘤通常具有增加的总微生物计数（Wilcoxon scPDA1，p = 0.015，scPDA2，p = 0.089；图2B）。条形码的子集也标记体细胞RNA（scPDA1，8.7%；scPDA2，8.9%），提供了这些细菌与宿主细胞共定位的证据。当我们对样本中的细胞相关细菌读序进行计数时，我们观察到细胞相关细菌仅在一部分肿瘤中有明显的数量，而在非恶性样本中几乎没有（41个肿瘤中有18个，14个非恶性组织中有1个；费希尔检验p = 0.009；图2C）。宿主细胞和细菌的条形码配对表明这些微生物与体细胞相关联，但并不表明它们是在细胞内还是细胞外；然而，成像数据表明，在胰腺肿瘤中检测到的大多数细菌是细胞内的。scPDA1和scPDA2肿瘤亚群中细胞相关细菌的显著增加提示了一种独特的(细菌细胞相关)肿瘤状态。这一发现与之前的报告一致，该报告在严格的实验条件下检测了PDA肿瘤子集（68%）中的胞内细菌，以控制污染。

然而，需要成对的肿瘤和正常邻近组织的scRNA-seq数据来说明与正常组织相比，肿瘤中细胞相关细菌的特异性。

伴有细胞相关感染的scPDA1和2肿瘤包含8-19个细菌属，其中许多与口腔或胃肠道病理相关。两组中最常见的细菌是弯曲杆菌属，已知其会导致胃肠道和全身炎症。其他细菌包括具核梭状芽孢杆菌，它与结肠直肠癌的肿瘤发生密切相关；钩端螺旋体属以前与胰腺癌相关的口腔微生物；以及艰难梭菌一种与胰腺病理相关的肠道病原体。尽管我们在绘图过程中包括了真菌和病毒基因组，但没有一个通过我们的去噪标准。

当我们用UMAP可视化体细胞数据时，我们观察到细菌在不同细胞类型中的分布是不均匀的（Fisher’s检验，p = 4e-5）并且细菌相关细胞通常在其细胞类型内聚集在一起，表明与非相关细胞相比，共有的、广泛的基因表达变化（图2D）。在所有细胞类型中都发现了细菌，这与显示恶性和免疫细胞中的细胞内细菌的肿瘤成像一致。肿瘤细胞的相关细菌总数最多（图2E）。使用Wilcoxon检验，我们确定了27种细菌细胞类型特异性富集，它们在scPDA1和scPDA2中是共有的（Wilcoxon，所有p < 5e-3；图2F）。肿瘤细胞再次具有最多的数量和最强的细菌富集。尽管免疫细胞与细菌共存（图2E），但我们仅发现3种细菌免疫细胞富集，表明免疫细胞与肿瘤内细菌存在非特异性相互作用。这些数据表明，胰腺肿瘤的一个亚群具有改变的微生物组，可能具有对恶性肿瘤细胞的细菌嗜性。

我们在14个非恶性样本中的13个样本中没有检测到任何细胞相关的细菌。我们还分析了另一个包含13个健康人类胰腺样本的第三个scRNA-seq研究，并在这些组织中没有发现微生物（Baron等，2016）；因此，在总体上，27个没有恶性病变的胰腺样本中，只有一个样本在细胞相关的细菌方面呈阳性，而PDAs则有44%的阳性率。然而，需要对配对的肿瘤和正常相邻组织进行scRNA-seq数据分析，以解决与正常组织相比，肿瘤中细胞相关细菌的特异性问题。

在具有细胞相关感染的scPDA1和scPDA2肿瘤中，存在着8至19个细菌属，其中许多与口腔或胃肠道病理有关。在这两个研究队列中最常见的细菌是菌属弯曲菌（Campylobacter spp.），它们已知会引起胃肠道和全身性炎症。其他细菌包括与结直肠癌中的肿瘤发生密切关联的核糖体核酸（F. nucleatum）；与胰腺癌有关的口腔微生物（Leptotrichia spp.）；以及与胰腺病理相关的肠道病原菌难辨梭菌（C. difficile）。虽然我们在映射过程中包括了真菌和病毒基因组，但没有一个基因组符合我们的去噪标准。

3. 细菌与细胞类型特异性的多样性和活动相关

Bacteria are associated with cell-type-specific diversity and activities

细胞关联的细菌簇集（图2D）引发了一种可能性，即主细胞在细菌存在的情况下会发生转录改变。我们首先想确定细胞关联的细菌是否与肿瘤中的体细胞状态多样性相关。我们计算了每个细胞的转录谱的香农多样性，然后对每种细胞类型，比较了带有检测到的细胞关联细菌和未检测到的细菌的肿瘤细胞的多样性值。在scPDA1和scPDA2中，带有细菌关联的细胞的样本在肿瘤和髓系细胞中的多样性显著增加，在T细胞群体中减少（图3G）。

我们接下来调查了细菌的存在是否与宿主细胞类型特异性基因表达相关。利用Wilcoxon检验，细菌和宿主细胞条形码的配对使我们能够确定在与特定细菌关联的细胞中表达差异的特定细胞类型基因。对于绝大多数检验的基因而言，表达没有显著差异（图3A）；然而，在scPDA1和scPDA2中，有一部分基因在同一方向上显著改变。在与细菌定位的细胞中，肿瘤细胞有最多的不同表达基因（图3B）。尽管细菌与许多免疫细胞共定位（图2E），但我们在共定位于细菌的淋巴细胞中没有发现共同的转录改变，只在髓系细胞中发现了15个不同表达基因（DEGs）。总共鉴定出571个独特的DEGs（详见附表S2），在所有细胞类型和细菌中，最常受影响的基因包括角蛋白、粘蛋白和三叶草蛋白基因（图3C）。

在scPDA1和scPDA2中，许多最强的与细菌相关的DEGs以前已与PDA或微生物群相关的炎症有关（图3D）。例如，在scPDA1和scPDA2中，与C. difficile定位的肿瘤细胞显著增加了EDIL3的表达（Wilcoxon，p < 2e-16），EDIL3是参与血管生成的整合素配体，被认为与多种组织的无菌和微生物诱导炎症以及PDA的肿瘤生长和不良预后有关。在scPDA1和scPDA2中，与H. pylori共定位的肿瘤细胞显著增加了CRABP2的表达（Wilcoxon，p < 2e-16），CRABP2是在口腔念珠菌病和癌症的体内模型中上调的一个癌基因。CRABP2还增强胰腺癌细胞的运动能力。在scPDA1和scPDA2中，与Francisella spp.相关的肿瘤细胞中OLFM4的表达增加。OLFM4是与微生物群诱导的上皮再生以及胰腺癌不良预后有关的干细胞标志物。在scPDA1和scPDA2中，正常导管上皮细胞与F. nucleatum共定位，REG3A的表达增加（Wilcoxon，p < 2e-16），REG3A是与调节宿主-微生物群相互作用密切相关的基因，还促进胰腺导管腺癌的前期阶段。这些发现以及附表S2中的其他内容表明，通过SAHMI鉴定的微生物群可能与PDA中的关键生长和炎症过程有关。

为了更广泛地研究与细胞关联的细菌相关的生物学过程，我们使用细胞类型和细菌特异性DEGs进行了Reactome通路基因集富集分析（图3E）。一般来说，细菌关联的存在与肿瘤细胞以及正常上皮和基质中与细胞运动、细胞外基质相互作用和免疫信号有关的多个通路的活性增加有关。这些通路包括MET-PTK2信号传导，与口腔病原体通过整合素/FAK信号传导促进癌症侵袭性的发现一致，以及整合素和非整合素膜-细胞外基质相互作用，与微生物扰乱组织完整性和癌症风险日益增加的证据一致。被上调的免疫通路包括与补体级联和PD-1信号有关的通路，与致病性真菌通过凝集素诱导的补体级联激活促进PDA的观察一致，以及肠道微生物群调节对抗PD-1治疗反应的证据一致。这些和其他通路数据，详见附表S3，因此将PDA中的微生物群与癌症标志活动相关联。

为了验证我们的观察结果，我们将scPDA1和scPDA2中的细菌-基因关联与TCGA胰腺癌队列中的结果进行了比较。我们在scPDA1、scPDA2和TCGA之间找到了12个19个属的共同之处，并将它们在TCGA中的标准化计数与相应的基因表达值进行了相关性分析。我们找到了100个显著的细菌-基因相关性，这些相关性与scPDA1和scPDA2细菌细胞类型特异性DEGs重叠（占所有可能比较的9.5%）。当我们使用子样本与样本标签混洗的数据重复该过程时，这种重叠与预期相比显著地更多（Wilcoxon检验，p < 2e-16；图3F），鉴于个体之间的微生物组成差异和TCGA数据的基因组覆盖有限，这一点值得注意。这些在单细胞分辨率下的观察一致地将微生物与肿瘤微环境中个体细胞类型的关键与癌症相关的细胞过程相关联。

图3 胰腺肿瘤中细菌与细胞类型特异性活动之间的关联

（A）细菌细胞类型特异性基因关联的火山图：这些图显示了Wilcoxon检验的结果，比较了带有共定位细菌的体细胞的基因表达值与没有共定位细菌的体细胞之间的差异。x轴表示带有共定位细菌的细胞与没有共定位细菌的细胞之间的平均log2折叠变化值，y轴表示Wilcoxon检验虚假发现率（FDR）校正后的p值。每个点的颜色表示点密度，黑色表示密度低，黄色表示密度高。

（B）柱状图显示每个细胞类型的显著基因-细菌对数量：这个图显示了每个细胞类型的显著基因-细菌对的数量，这些对在scPDA1和scPDA2中都是共享的。显著基因是根据（A）中的分析确定的，其中FDR校正的p值<0.05，并且在scPDA1和scPDA2中具有相同方向的倍数变化。

（C）排名散点图显示每个显著基因不同细菌或不同细胞类型中不同表达的次数：这个散点图显示了每个显著基因在不同细菌或不同细胞类型中不同表达的次数。与前面的图一样，显著基因是根据（A）和（B）中的分析确定的。

（D）箱线图比较带有特定共定位细菌属的细胞的基因表达值：箱线图比较带有特定共定位细菌属的细胞（+）和没有共定位细菌属的细胞（-）的基因表达值。X表示均值。

（E）点图显示scPDA1和scPDA2共享的DEGs富集的Reactome途径：这个点图说明了scPDA1和scPDA2共享的不同表达基因（DEGs）富集的Reactome途径。点的颜色按细胞类型着色，大小按p值进行缩放。显示了FDR校正的p值<0.05的途径（超几何检验）。

（F）箱线图比较scPDA1、scPDA2和TCGA数据之间共享的细菌-基因关联数量：这个箱线图比较了scPDA1、scPDA2和TCGA数据之间共享的细菌-基因关联数量。这些关联是从子样本和样本标签随机化的数据中计算出来的。使用Wilcoxon检验进行比较。

4. 携带细菌的肿瘤中的T细胞被激活

Tumors with cell-associated bacteria have activated T cells

尽管在个体T细胞中配对的DEGs不多，但我们想要确定在是否带有细胞相关细菌的肿瘤中是否存在总体上的T细胞亚型差异。我们整合了来自scPDA1和scPDA2的T细胞数据，并基于经典的亚型标记物识别出调节性、记忆性、效应性和自然杀伤性T细胞（图4A、4B和S2B）。与没有细胞相关细菌的肿瘤相比，携带细胞相关细菌的肿瘤中的T细胞更有可能具有激活的表型（即自然杀伤性T细胞、效应性T细胞），而不太可能具有调节性表型（Fisher's检验，p = 1e-4；图4A）。作为一个细胞群体，与没有细胞相关细菌的肿瘤中的T细胞相比，携带细胞相关细菌的肿瘤中的T细胞有多个在两个scPDA队列中共享的DEGs（图4C），并且在一些相关通路中富集（图4D）。在携带细胞相关细菌的肿瘤中上调的通路包括PD-1信号通路，与我们的发现一致，即与细菌配对的个体肿瘤细胞也具有增强的PD-1信号通路，以及对细胞内感染的响应（两者都是超几何分布检验，校正p = 0.04）。下调的通路包括FOXO介导的转录和干扰素γ信号通路，与这些肿瘤中的调节性T细胞相对较少的情况一致（图4A和4D）。这些结果与最近的报告一致，表明肿瘤内的细菌诱导了免疫浸润和抗肿瘤反应。

图4 带有细胞相关细菌的肿瘤中的T细胞亚型

（A）经过批次校正的scPDA1和scPDA2中的T细胞的UMAP图。左：按研究着色。中：按主要的T细胞亚型着色。右：按同一肿瘤样本中是否存在细胞相关细菌着色。表：带有或不带有细胞相关细菌的肿瘤中的T细胞亚型计数。

（B）经过批次校正的scPDA1和scPDA2中的T细胞数据的UMAP图，根据选择的T细胞亚型标记物的标准化表达着色。

（C）带有或不带有细胞相关细菌的肿瘤中T细胞的共有显著差异表达基因DEGs（Wilcoxon检验）在scPDA1和scPDA2中。条的长度表示平均log2(倍数）。

（D）来自（C）的DEGs的Reactome通路富集结果。

5. 大多数胰腺导管腺癌（PDA）的T细胞被预测为具有与感染相关的转录谱

The majority of PDA T cells are predicted to have infection-related transcriptional profiles

广泛的细菌-免疫细胞共定位以及与免疫相关的信号传导在scPDA的两个队列中的存在，表明微生物组影响了PDA的免疫应答。我们想要确定肿瘤微环境中单个T细胞的目标。为此，我们构建了一个随机森林模型，以区分T细胞对已知感染或其他微生物贫乏肿瘤的反应。首先，我们使用从脓毒症患者或已知微生物负荷较低的肿瘤（基于TCGA的数据和16S-rDNA测序的数据）中采样的T细胞训练了一个模型，将T细胞分类为具有感染微环境反应（IMER）或肿瘤微环境反应（TMER）。然后，我们在来自五种已知微生物负荷较低的癌症类型的每个样本中（每个样本超过10万个细胞），以及来自代表细菌或真菌感染或刺激的三个数据集中进行了模型检验（图5A）。当分类T细胞TMER时，该模型表现出色，即能够准确区分受微生物或肿瘤刺激的T细胞（曲线下面积[AUC] = 0.98；图5B）。接下来，我们使用这个模型在scPDA1和scPDA2中识别了IMER和TMER T细胞。在这两个PDA队列中，绝大多数T细胞被分类为具有IMER模式（scPDA1，90％的IMER；scPDA2，92％的IMER；图5C）。这个结果表明，在PDA中，T细胞的转录组特征更类似于具有感染微环境的T细胞，而不是模型检验中使用的其他肿瘤类型（图5A）。这一发现解释了为什么胰腺肿瘤具有高水平的炎症反应，并且对免疫治疗反应不佳。

图5 T细胞微环境反应和生存模型

（A）使用基因表达谱创建随机森林模型来区分T细胞IMER和TMER的训练和检验数据集。

（B）受试者操作特征曲线（ROC曲线）显示检验数据集上模型表现优异。AUC表示曲线下面积；IMER表示感染微环境反应；TMER表示肿瘤微环境反应。插图：模型分配的混淆矩阵。行代表预测值，列代表实际值。

（C）在scPDA1和scPDA2中预测的T细胞TMER的条形图。

（D）开发一个分类模型，使用7个基因表达值预测肿瘤中是否存在细胞关联的细菌。混淆矩阵显示模型在scPDA1和scPDA2上的分类准确率。

（E）根据预测的细胞关联细菌存在与否，分层绘制TCGA、ICGC和CPTAC PDA队列的Kaplan-Meier曲线。p值由Cox比例风险模型确定。

6. 微生物组特征对存活率分层

Microbiome characteristics stratify survival

最后，我们调查了肿瘤内微生物特征是否与总体生存率相关。由于目前不存在带有生存数据的大规模单细胞PDA数据集，我们开发了一个模型，根据肿瘤的整体mRNA表达来对带有或不带有细胞相关细菌的肿瘤进行分类，然后使用该模型预测TCGA，ICGC和CPTAC中胰腺肿瘤的感染状态。简而言之，我们首先从scPDA数据集中创建了伪批量基因表达谱，通过对样本中的所有细胞进行基因计数求和得到。我们确定了肿瘤带有或不带有细胞相关细菌的最显著差异表达基因（TLL1、CHRDL1、PSCA、DKK1、KLRC2、MEOX1和ADAMTS5），并使用这些基因开发了一个梯度提升树模型来分类细菌状态。该模型在scPDA1和scPDA2中能够准确地区分具有或不具有细胞相关细菌的肿瘤（图5D）。然后，我们使用该模型来预测TCGA、ICGC和CPTAC的胰腺肿瘤的感染状态，并使用单变量Cox比例风险模型检验与生存之间的关系。在TCGA和ICGC中，预测带有细胞相关细菌的存在与显著降低的总体生存率相关（TCGA：风险比[HR] = 2.1，95%置信区间[CI]：1.4–3.6，p = 0.006；ICGC：HR = 1.5，95% CI：1.1–2.0，p = 0.019；图5E）。在CPTAC数据集中观察到相同的趋势，尽管效应大小和样本量较小（HR = 1.3，95% CI：0.8–2.3，p = 0.35）。这些结果表明，在某些患有胰腺癌的个体中，肿瘤微生物组可能具有临床相关性。

- 讨论 -

在这项研究中，我们使用SAHMI以单细胞分辨率分析了两个独立的胰腺癌研究中的肿瘤微生物相互作用。我们的发现经过了在两个数据集中的一致性观察验证，并与使用四种不同技术平台测序的其他PDA队列的观察结果相一致。我们展示了有关微生物在这些组织中的系统检测，并发现SAHMI成功地识别出已知的病原体，并且感染样本中的病原体读序与病原体负载成正比显著增加。正如文献中所指出的，有几种可能性可以解释scRNA-seq定量捕获微生物读序的情况：（1）RNA捕获可以通过在内部富含腺嘌呤的位点上引发引物合成；（2）原核生物转录本可能比之前认为的更具多聚腺苷酸化；（3）微生物可能改变其外包膜或变为细胞壁缺陷，类似于L-形态切换；以及（4）非多聚腺苷酸化的哺乳动物序列，例如来自非编码基因或距离转录本3端较远的区域，常常在scRNA-seq中被捕获。已经显示出使用聚A选择的人类RNA-seq进行微生物分析在科学和临床上具有实用性。了解在单细胞工作流中捕获微生物序列的起源和机制是未来研究的重要方向。考虑到我们的多重验证分析和仅通过使用scRNA-seq发现的发现，我们相信SAHMI代表了我们研究宿主-微生物相互作用能力的显著进步。虽然我们避免从相关性中推断因果关系，但我们的观察产生了关于肿瘤-微生物全基因组演化的可检验假设，其中微生物与肿瘤、免疫和基质细胞之间的相互作用可能调节肿瘤发生和抗肿瘤反应。胰腺癌长期生存者的肿瘤产生与微生物肽段同源的新抗原。与免疫疗法应答性癌症类型不同，我们的数据提供了证据，表明大多数浸润性淋巴细胞在PDA中具有与感染相关的微环境中的T细胞相似的转录谱；这一发现可以解释免疫检查点抑制剂在PDA中无效的原因（Feng等，2017）。如果PDA浸润性T细胞大多显示IMER，那么与微生物肽段同源的肿瘤新抗原可能会增加对抗肿瘤免疫反应的易感性。然而，肿瘤中的微生物群落，或者表达微生物抗原的肿瘤，也可能通过吸引调节性T细胞，然后将巨噬细胞极化为免疫抑制表型而对PDA中的典型免疫抑制产生影响。肿瘤新抗原与微生物模仿之间以及抗肿瘤反应之间的关系可能反映出免疫识别和新抗原表达动态之间的平衡。总体而言，关于T细胞全局转录反应的观察对免疫治疗具有重要意义；针对IMER或TMER T细胞的不同治疗靶向可能具有临床效用，机制研究将需要来证实或否定这些可能性。

最后，我们使用SAHMI获得的细胞相关细菌特征可以预测生存不良的个体，这与观察结果一致，即抗生素减少细菌数量可增强吉西他滨在人体内的疗效，并改善小鼠对检查点抑制剂（CPIs）的PDA反应。尽管广谱抗生素治疗已与CPI对人体反应的降低相关，但CPI的反应可能会受到微生物组成的影响，并且微生物效应可以通过微生物转移来调节。虽然我们的模型预测了感染肿瘤的更差预后，但其他人已经报道胰腺癌长期生存者的肿瘤中存在增加的肿瘤内细菌多样性。这种二分法可能反映了技术平台（批量mRNA/单细胞mRNA/16S rDNA）、样本处理（新鲜/冷冻/福尔马林固定、石蜡包埋）之间的差异，或只有一部分微生物会促进肿瘤生长。因此，更高的总体多样性可能会抑制更具致病性的亚群的影响，并带来生存优势。进一步的研究将需要解决这一点。

我们的单细胞分辨率观察确认了使用批量基因组数据、模型系统或定向实验已知的许多肿瘤-微生物关联。然而，我们的研究还存在重要局限性。首先，虽然我们采取了几项在线上措施来最小化污染和低质量数据，但这些不能取代金标准的微生物学实践，包括无菌处理、无菌认证的试剂、试剂的负空白和多个样本池化作为“阳性”对照。尽管污染物不应该在相同处理的样本中进行成对比较，但它们可能会限制较小研究或研究间比较的解释。其次，我们保守的数据处理筛选了广泛存在的微生物分类，但它们可能会消除个体特异性、区域特异性、低丰度或难以检测的分类。第三，非特异性RNA捕获可能会影响特定分类的检测率并影响总体微生物组成。第四，我们无法确定检测到的微生物核酸来自活体、溶解的或细胞内或细胞外微生物。与之前的研究一样，我们的数据也没有建立起微生物与肿瘤微环境之间的直接因果关系；即微生物是否致癌或促炎症，或者它们是否代表了已建立的肿瘤的感染。我们也不能评估环境暴露或先前的医疗干预（例如，保持小肠与胰腺之间通信的术前胆管支架或抗生素使用）在选择人体样本中的观察微生物配置时的作用。需要进一步的研究来直接检验因果关系。不过，SAHMI为在不需要额外实验修饰的情况下从单细胞测序数据中检查人类-微生物相互作用模式创造了机会，从而为多个层次的宿主-微生物关系生成可检验的假设。这一框架不限于肿瘤特定，可应用于研究各种组织和疾病状态，以及其他感染因子，如病毒、真菌或寄生虫。

参考文献

Ghaddar B, Biswas A, Harris C, et al. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer[J]. Cancer Cell, 2022, 40(10): 1240-1253. e5.

- 作者简介 -

第一作者

罗格斯大学

Bassel Ghaddar

医学博士

主要关注运用定量分析和机器学习方法对单细胞基因组测序数据进行研究，以研究肿瘤微环境中的细胞间和细胞-微生物相互作用。目前在Cancer Cell、NAR等期刊发表论文9篇，总计被引用317次。

参考：

=zh-CN&user=vouQ2BEAAAAJ；

罗格斯大学

Antara Biswas

博士后

她致力于利用实验方法和计算工具来探索单细胞水平上推动肿瘤进展的肿瘤内异质性和多样细胞状态。目前在Cancer Cell、American Journal of Physiology-Cell Physiology等期刊发表论文12篇，总计被引165次。

参考：

=zh-CN&user=IPnZS1kAAAAJ；

通讯作者

罗格斯大学

先进生物技术和医学中心

Martin J. Blaser

教授、主任

担任美国罗格斯大学（Rutgers University）人体微生物组领域的主席，兼任医学和微生物学教授，同时担任先进生物技术与医学中心（Center for Advanced Biotechnology and Medicine）的主任。此前，他曾担任纽约大学医学系的主任。作为一名医生和微生物学家，Blaser博士长期从事人类与持续寄生的细菌之间的关系研究。他的工作在过去30年聚焦于弯曲菌属（Campylobacter species）和幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），这两者也是了解细菌与宿主之间相互作用的模型系统。在过去的20年里，他还积极研究人体微生物组与健康以及哮喘、肥胖、糖尿病和癌症等重要疾病之间的关系。他目前担任总统抗击耐药细菌咨询委员会（PACCARB）的主席。他拥有28项美国专利，并在Nature、Cell、Science等顶级杂志发表了600多篇原创文章，总计被引用156612次，h指数182。他还著有《失落的微生物》一书，该书面向广大读者，已被翻译成20种语言。

参考：

；=zh-CN&user=gr50sj4AAAAJ

罗格斯大学

癌症研究所

Subhajyoti De

副教授

在印度理工学院获得工程学士学位，后在剑桥大学获得博士学位，并在哈佛公共卫生学院完成博士后研究。他致力于如何利用对癌症起源和进展的认识来更好地检测和治疗癌症。在Nature、Nature Genetics等杂志发表文章58篇，总计被引6860次，h指数40。

参考：

；

=zh-CN&user=4zXHZS0AAAAJ

猜你喜欢

iMeta简介 高引文章 高颜值绘图imageGP 网络分析iNAP
iMeta网页工具 代谢组MetOrigin 美吉云乳酸化预测DeepKla
iMeta综述 肠菌菌群 植物菌群 口腔菌群 蛋白质结构预测

10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树 必备技能：提问 搜索  Endnote

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

生物科普:  肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘  

写在后面

为鼓励读者交流快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”讨论群，己有国内外6000+ 科研人员加入。请添加主编微信meta-genomics带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。高级职称请注明身份，另有海内外微生物PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读