Worthington 肝细胞分离系统说明书

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Worthington 肝细胞分离系统说明书

内切蛋白酶-Lys-C 是一种丝氨酸内切蛋白酶，可特异性切割赖氨酸羧基侧的肽键。它的分子量为 30,000 道尔顿，在 7.0-9.0 的最佳 pH 范围内使用。Lys-C 被氟磷酸二异丙酯、TLCK、抑肽酶和亮肽素抑制。

已发表的用于分离肝细胞的大多数传统方法使用粗制和部分纯化的酶制剂，包括各种类型的胶原酶和其他蛋白酶。最近，使用具有更好特征的胶原酶制剂，例如 Worthington 1 型和 4 型 (CLS-1, 4) 提供了更好的结果。所有粗制胶原酶制剂都可能包含批次可变的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人员预先筛选几批酶和/或不断修改分离参数和方案。

 Worthington艾美捷肝细胞分离系统的开发旨在为研究人员提供可靠、方便和一致的肝细胞分离系统。通过使用该试剂盒中包含的预先优化的酶组合，可以最大限度地减少批次间的差异并提高分离肝细胞的质量。此外，Worthington 通过从成年大鼠中分离肝细胞对每批产品进行使用测试，以确保活细胞的性能、可靠性和一致的产量。

该方法基于 Berry, MN 所描述的方法，由 Seglen, PO 修改（细胞生物学方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 编辑，学术出版社，1976 年；第 4 章，“分离的大鼠肝细胞的制备”， pp 29-83），并与几位研究人员一起进一步优化。

稳定性/储存: 试剂在环境温度下在正常运输过程中的预期时间内是稳定的，但包装在到达时应冷藏。使用前，内容物可在 2-8°C 下储存 4-6 个月。储存在 2-8°C。

包装内容 该包装包含足够的材料，可用于五次单独的成年大鼠肝脏灌注。对于更大或更小的组织应用，请在每个步骤中准备相应体积的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 浓缩液，1 瓶，500ml 无菌不含钙和镁的汉克平衡盐溶液 (CMF-HBSS)。该溶液用于在加入解离酶溶液之前洗涤和灌注肝脏。

小瓶 #2：22,500 单位胶原酶和 30 单位弹性蛋白酶，5 瓶 Worthington 胶原酶（代码：CLS-1）和弹性蛋白酶（代码：ESL），通过 0.22 µm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

3 号小瓶：每个 1,000 单位 DNase I，5 瓶 Worthington DNase I（代码：D），通过 0.22 µm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 缓冲浓缩液，用于缓冲重构的 Leibovitz L-15 培养基。5 号小瓶：7.5% 碳酸氢钠 (NaHCO3)，1 瓶，100ml 7.5% 碳酸氢钠浓缩液，用于缓冲稀释的 CMF-HBSS。

小袋，包含 Leibovitz L-15 培养基粉末，1 x 1L 通过切开信封顶部并将内容物倒入含有大约 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重构小袋的全部内容物。用额外的 100 毫升水冲洗袋子 2 - 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。

Worthington 艾美捷肝细胞分离系统部分参考文献：

Alpini et al., "Recent Advances in the Isolation of Liver Cells", Hepatology (1994) 20:494-514.

Berry, M.N., Edwards, A.M., and Barritt, G.J.; Isolated Hepatocytes: Preparation, Properties and Applications, RH Burdon and PH Van Knippenberg, eds., Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, Chapt. 2, 1991.

Chen H-L, Wu H-l, Fon C-C, Chen P-J, Lai, M-Y, Chen D-S (1998) Long-term culture of hepatocytes from human adults. Biomedical Science 5:435-440

DeRobertis, E.D.P., Saez, F.A. and DeRobertis, E.M.F.: Cell Biology, 6th ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1975.

Freshney, R. Ian: Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York, 2000.

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