Worthington对肝细胞分离系统的测试及相关优化方案

肝细胞分离系统的测试及相关优化方案"/>

Worthington对肝细胞分离系统的测试及相关优化方案

肝细胞分离系统：

已发表的用于分离肝细胞的大多数传统方法使用粗制和部分纯化的酶制剂，包括各种类型的胶原酶和其他蛋白酶。

最近，使用具有更好特征的胶原酶制剂，例如 艾美捷 Worthington 1 型和 4 型 (CLS-1, 4) 提供了更好的结果。所有粗制胶原酶制剂都可能包含批次可变的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人员预先筛选几批酶和/或不断修改分离参数和方案。

Worthington 肝细胞分离系统的开发旨在为研究人员提供可靠、方便和一致的肝细胞分离系统。通过使用该试剂盒中包含的预先优化的酶组合，可以最大限度地减少批次间的差异并提高分离肝细胞的质量。此外，Worthington 通过从成年大鼠中分离肝细胞对每批产品进行使用测试，以确保活细胞的性能、可靠性和一致的产量。

 

该方法基于 Berry, MN 所描述的方法，由 Seglen, PO 修改（细胞生物学方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 编辑，学术出版社，1976 年；第 4 章，“分离的大鼠肝细胞的制备”， pp 29-83），并与几位研究人员一起进一步优化。 

稳定性/储存：试剂在环境温度下在正常运输程序中预期的一段时间内是稳定的，但包装在到达时应冷藏。使用前，内容物可在 2-8°C 下保存 4-6 个月。储存在 2-8°C。

包装内容 该包装包含足够的材料，可用于五次单独的成年大鼠肝脏灌注。对于更大或更小的组织应用，请在每个步骤中准备相应体积的试剂，并按照协议中所述的相同比例将它们组合起来。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 浓缩液，1 瓶，500ml 无菌不含钙和镁的汉克平衡盐溶液 (CMF-HBSS)。该溶液用于在加入解离酶溶液之前洗涤和灌注肝脏。

小瓶 #2：胶原酶-弹性蛋白酶小瓶，5 瓶 Worthington 胶原酶（代码：CLS-1）和弹性蛋白酶（代码：ESL），通过 0.22μm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

3 号小瓶：每个 1,000 单位 DNase I，5 瓶 Worthington DNase I（代码：D），通过 0.22 µm 孔径膜过滤，并冻干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液复溶，并按照以下步骤轻轻旋转以溶解内容物。将未溶解的小瓶储存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 缓冲浓缩液，用于缓冲重构的 Leibovitz L-15 培养基。

 5 号小瓶：7.5% 碳酸氢钠 (NaHCO3)，1 瓶，100ml 7.5% 碳酸氢钠浓缩液，用于缓冲稀释的 CMF-HBSS。  

小袋，包含 Leibovitz L-15 培养基粉末，1 x 1L 通过切开信封顶部并将内容物倒入含有大约 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重构小袋的全部内容物。用额外的 100 毫升水冲洗袋子 2 - 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。

灌注隔离所需但不包括在内：  

• 用于动物麻醉和手术的设备和工具

• 带有气泡捕集器的灌注装置，适用于10-30ml/min、37°C 的肝脏灌注。插入门静脉的管子是薄壁的，内径为 0.35-0.45mm 注意：测量灌注回路的死体积

• 适用于肝细胞沉降的低速离心机 • 用于细胞沉降、培养或孵育的实验室器具，包括无菌 150 X 25mm 培养板

• 一种计数或估计细胞产量的方法 • 一种无菌过滤溶液的方法，如果需要的话

• 细胞培养基和用品（如果需要） • 无菌细胞培养级水

• 浓缩抗生素：如果需要，用于培养的青霉素、链霉素、Fungazone 等。

• 手术线，丝绸，000 号

• 肝素（可选）

 对于细胞定量和活力评估： • 改进的 Neubauer 血细胞计数器 • 计数器 • 巴斯德移液器或微量移液器 • 显微镜 (10X)，最好是倒置相差 • 标准 10ml 血清移液器

注意：以下程序假定以前在肝脏消化和细胞分离方面的经验。对于那些没有经验的人，请参阅上面提到的 Seglen 的出版物或 Alpini 等人的出版物。题为“Recent Advances in the Isolation of Liver Cells”的文章发表于 Hepatology (1994) 20:494-514。Berry, MN, Edwards, AM 和 Barritt, GJ；RH Burdon 和 PH Van Knippenberg, eds., Elsevier, Amsterdam,纽约，牛津，第 2 章，（1991 年）。  

一、1肝消化的初步步骤  

以下协议中指定的体积适用于大约 80-100ml 的灌注体积。对于不同的灌注系统，可能需要进行比例调整。

注意：应使用无菌技术、玻璃器皿和塑料器皿。还建议使用无菌罩以避免培养物污染。  

准备：  

1 号瓶，10X CMF-HBSS：用 850 毫升无菌水稀释 100 毫升 10X CMF-HBSS，并在 1 升无菌瓶中加入 4.7 毫升 7.5% 碳酸氢钠（5 号瓶，NaHCO3）。如有必要，将 pH 值调节至 7.4。用无菌水使 (QS) 的总体积达到 1L。如果没有无菌水，混合成分和无菌 (0.22u) 过滤器。总共5L。  

• Leibovitz L-15 培养基，1 x 1L：通过切开信封顶部并将内容物倒入装有 800 毫升细胞培养级水的烧杯中，重新配制袋中的全部内容物。用额外的 100 毫升水冲洗袋子 2 - 3 次。使总体积达到 1000 毫升并通过 0.22 微米孔径的膜过滤。  

 • 酶缓冲液：将 13.3ml MOPS 浓缩液与 10ml 无菌水和 76.7ml L-15 混合在一个 100ml 无菌瓶中。将足够的 L-15/MOPS 转移到每个小瓶 #2 和一个小瓶 #3 中以溶解内容物，轻轻混合以完全溶解并将酶转移回 100 毫升瓶中。胶原酶、弹性蛋白酶和 DNase 的浓度分别约为 225U/ml、0.3U/ml 和 10U/ml。  

• 用CMF-HBSS 冲洗无菌灌注装置，排除系统中的所有空气，除气泡阱中的空气。  

• 将 150 x 25mm 或同等大小的培养皿放在灌注装置附近以接收灌注的肝脏。

二、成年大鼠肝脏的灌注和消化  

以下步骤应在层流罩或安全柜中执行。特别是，消化的肝脏应在无菌条件下进行处理，除非急性孵育会终止程序。

1. 用肝素对大鼠进行预处理是有帮助的。灌注前约 20 分钟腹腔注射，或在打开腹部后注入静脉（Seglen 建议使用髂腰静脉）。使用范围为 100-200U/100g 体重。  

2. 麻醉一只体重 200-400g 的大鼠，并将其定位以进行解剖。在大鼠下安装足够的衬垫以保持血液和初始灌注液。将老鼠放在它的背上, 用胶带把腿贴下来, 用碘溶液或 70% 乙醇对腹部进行消毒, 然后打开腹部露出肝脏。将肠子移到腹部的左侧（当你向下看时，老鼠的头远离你，向右移动）暴露肝门静脉。  

3. 使用一对细的弯曲镊子，将一段 000 手术线放置在门静脉下方和门静脉周围，就在门静脉和靠近肝脏的最终肠系膜静脉的交叉点上方（朝向头部）。在静脉周围打一个松散的半方形或等效结。找到腔静脉，以便在门静脉 (vena porta) 被插管之前打开以进行引流。   

4. 以 10-15ml/min 的流速打开含有普通 CMF-HBSS 的灌注泵，以便将管子或套管插入门静脉。调节浴温以使灌注液温度为 37°C。在右肾附近的腔静脉切一个切口以降低血压，然后用细手术剪在门静脉（部分穿过）在打结的线下方（朝向尾部）约 5 毫米处切一个切口。将管子插入门静脉，朝向肝脏，距松结仅几毫米。肝脏应该没有血液。将手术线紧紧地系在门静脉和管道周围。切开腔静脉并将灌注液流速增加到 20-25ml/min。笔记：

5. 小心地从动物身上取出肝脏；不着急。将肝脏放在网状舞台上，使其可以以循环方式灌注。然而，最初的 CMF-HBSS 灌注液被浪费了。  

6. CMF-HBSS 灌注 7-10 分钟后，转用酶缓冲液（含有酶的 L-15 消化培养基）进行灌注。在剩余 CMF-HBSS 的一个系统死体积被浪费后开始再循环。  

7. 用消化混合物灌注肝脏，直到它完全膨胀（但不会过早）并且肝脏被完全消化，大约需要 20-30 分钟。注意：如果门静脉破裂或肝脏表面在用镊子或钝物接触时出现崩解迹象，请立即停止灌注并取出肝脏。

8. 灌注结束，停止泵，轻轻将肝脏置于 150ml 或等量的培养皿中，取出灌注管。如果尚未将培养皿转移到无菌罩中，则向培养皿中加入大约 150ml 新鲜的 CMF-HBSS。   

9. 在培养皿中，用镊子或狗梳（Seglen 推荐）轻轻撕下小叶囊膜，并耙出细胞。去除结缔组织和血管组织的大中央树，以及任何未消化的组织或结缔组织。  

10. 轻轻搅拌培养皿以分散细胞。通过将一侧支撑在盖子上，将盘子倾斜放置。让团块或结缔组织静置一分钟左右，然后在板的最深处，即靠近下边缘，从缓冲液顶部取出分散的细胞，并将细胞悬液转移到 50ml 无菌管中。  

11. 在室温下低速离心 3 分钟（对于松散的细胞团块来说足够快，例如 100 xg）。  

12. 向培养皿中加入更多的 CMF-HBSS，重复该过程以增加细胞产量。只要可以去除干净的细胞，就重复。

13. 细胞沉淀后，立即加入新鲜的 CMF-HBSS，倒置加盖的试管以悬浮细胞，并按上述方法重新离心。再次重复该过程以从细胞中去除消化酶的痕迹。弃去上清液，将细胞转移到培养基或第二个 100mm 或 150mm 培养皿中的缓冲培养基中。在离心机中温和沉降后，良好消化 300 克大鼠肝脏的细胞产量约为 4-5 毫升填充体积。  

肝细胞培养（可选）

尽管特定于应用，但肝细胞已在多种培养基中培养，包括 DMEM、Leibovitz's L15、改良 Chee's 培养基、Williams E 培养基、RPMI 和 Waymouth's MB 752/1。一般来说，媒体都补充了许多因素，以保持差异化状态。其中包括 EGF、胰岛素、胰高血糖素、地塞米松、亚硒酸盐、烟酰胺和肝细胞生长因子（Chen 等，1998）。肝细胞专用培养基可从其他供应商处购买。为了成功地培养肝细胞，培养器皿通常涂有基质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白或某种类型的商业基质。

肝细胞培养的进展包括使用胶原蛋白或 MatrigelTM 的三维基质（凝胶）。陈等人。(1998) 将肝细胞铺在 MatrigelTM (TMBecton Dickinson, Bedford MA) 上，几周后取出细胞并将它们重新铺在胶原凝胶上。24小时后，加入第二层胶原凝胶。或者，可以将细胞直接铺板在胶原凝胶中并保持为三维培养物。

一篇综述讨论了培养变量对人类肝细胞的影响（Le Cluyse，2001），并且可能适用于其他物种的肝细胞培养。同一作者回顾了大鼠肝细胞培养的最佳条件（Le Cluyse 等，1996）。