5+非肿瘤+WGCNA+PPI+实验，简单WGCNA分析思路，干湿结合

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5+非肿瘤+WGCNA+PPI+实验，简单WGCNA分析思路，干湿结合

今天给同学们分享一篇非肿瘤+WGCNA+PPI的生信文章“Identification and Evaluation of Hub Long Noncoding RNAs and mRNAs in High Fat Diet Induced Liver Steatosis”，这篇文章于2023年2月14日发表在Nutrients期刊上，影响因子为5.9。

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）被认为是最常见的慢性肝病，但对NAFLD机制的理解仍然有限。作者的研究旨在探索高脂饮食（HFD）诱导和番茄红素干预的肝脂肪变性中的关键长链非编码RNA（lncRNA）和mRNA以及病理过程。

图1 流程图

1. 加权共表达网络构建和关键模块识别

通过聚类分析从GSE146627数据集的9个样本中鉴定出了1602个lncRNA和2202个mRNA。使用R语言验证数据完整性，并构建网络拓扑图以确定软阈值功率β值为10（图2a）。然后，基于软阈值构建共表达矩阵。此外，通过计算基因邻接性和差异系数构建聚类树状图（图2b）。使用动态剪切方法将11个模块（青色、蓝色、棕色、黄色、绿色、红色、黑色、粉色、洋红色、紫色和灰色）分离出来，并在表1中显示了这些模块中的lncRNA和mRNA数量。

图2 使用WGCNA来识别与特征相关的模块和基因

2. 模块与特征的相关性分析

共表达模块与膳食干预的关系如图3所示。作者发现，蓝绿色模块与HFD + 茄红素呈最强正相关（相关系数=1，p值=2 × 10 −9 ），而黑色模块与HFD呈最强正相关（相关系数=0.87，p值=0.002）。根据表1和图3的结果，作者选择了蓝绿色、蓝色、棕色、黄色、绿色和黑色模块中的长链非编码RNA和信使RNA进行进一步的网络调控分析。

图3 模块-特征关系

3. GO和KEGG通路分析

作者对GO术语和KEGG通路进行了富集分析，以确定这些模块是否由功能相似的基因组成，并了解网络模块的功能意义。青绿色、蓝色、棕色、黄色、绿色和黑色模块中的mRNA经过了GO和KEGG通路的富集分析。结果显示，在前20个GO术语中，转录的调控由RNA聚合酶II、脂质代谢过程、凋亡过程、脂肪酸代谢过程、类固醇生物合成过程、磷酸化、RNA剪接以及I-kappa B激酶/NF-kappa B信号通路的正调控富集在图4a、b（青绿色和蓝色模块）和图S2a（棕色、黄色、绿色和黑色模块）中。KEGG通路富集分析表明，差异表达的mRNA主要在代谢通路、TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用中发挥关键作用（图4c、d和图S2b）。综上所述，这些结果表明这些模块中的基因与炎症和代谢之间存在强烈的相关性。

图4 对于蓝色和青色模块的功能富集分析

4. 构建lncRNA-mRNA共表达网络

建立了lncRNA-mRNA共表达网络，以检测lncRNA在关键模块中的功能机制（图4）。在蓝绿色模块中，有46个lncRNA和38个mRNA作为中心基因（图5a）。在蓝色模块中，作者检测到了29个lncRNA和29个mRNA作为中心基因（图5b）。棕色、黄色、绿色和黑色模块中的中心基因详见附图S3。作者发现lncRNA和mRNA之间存在相互调控的关系。此外，一个lncRNA可以与多个mRNA共表达，多个lncRNA也可以与一个mRNA共表达，揭示了lncRNA-mRNA共表达网络中的全面调控关联。

图5

5. lncRNA-mRNA通路网络的构建

为了确定长链非编码RNA介导的信号通路调控的潜在机制，作者相互作用了显著不同的通路和长链非编码RNA-信使RNA共表达网络，得到了长链非编码RNA-信使RNA通路网络（图5）。在通路网络中，蓝绿色模块（图5c）有20个长链非编码RNA和7个信使RNA，蓝色模块（图5d）有12个长链非编码RNA和4个信使RNA。在蓝绿色模块中，Smarca2（一种长链非编码RNA）与三个信使RNA（Cir1、Ralbp1和Lpin1）相关，并富集于Epstein-Barr病毒感染、代谢通路、mTOR信号通路、甘油磷脂代谢、甘油脂代谢、癌症通路、胰腺癌和Ras信号通路。Tacc1（一种长链非编码RNA）与3个信使RNA（Prkce、Ube3a和Efna5）相关，并丰富于19个信号通路，如轴突引导、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路、癌症中的微小RNA、Ras信号通路、胰岛素抵抗、2型糖尿病和人类乳头状瘤病毒感染。

在蓝色模块中，Flywch1（一种长链非编码RNA）与三种mRNA（Foxp3、Mef2c和Serpine1）相关，并在炎症性肠病、癌症转录调控异常、甲状旁腺激素合成、分泌和作用、催产素信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路、Apelin信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中、HIF-1信号通路、p53信号通路和细胞衰老中富集。Rnf169（一种长链非编码RNA）也与两种mRNA（Foxp3和Mef2c）相关，并在炎症性肠病、癌症转录调控异常、甲状旁腺激素合成、分泌和作用、催产素信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路、Apelin信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化中丰富。

6. 蛋白质相互作用网络的构建

为了研究模块中关键基因之间的互动关系，作者将这些核心基因提交到STRING数据库中构建蛋白质相互作用网络（图6）。图6a展示了蓝绿色模块中的蛋白质相互作用网络；根据蛋白质相互作用分析，蓝绿色模块中有28个关键基因。图6b展示了紫色模块中的蛋白质相互作用网络；根据蛋白质相互作用分析，紫色模块中有23个关键基因。

图6 在蓝色模块（b）和绿松石色模块（a）中构建蛋白质相互作用（PPI）网络

7. 血红素-伊红染色

经过10周的正常饮食、高脂饮食和高脂饮食+番茄红素喂养后，用HE染色检测了肝组织。结果显示，与正常饮食组相比（图7a），高脂饮食组的肝细胞呈现肿胀和松散排列，大多数肝细胞中存在不同大小和数量的脂滴空泡（图7b）。这表明高脂饮食可能导致小鼠肝细胞脂肪变性，从而促进NAFLD的发展。然而，高脂饮食+番茄红素喂养导致肝细胞肿胀、肝细胞脂肪变性和大型脂滴空泡的减少，与高脂饮食组相比（图7c）。结果表明，番茄红素的补充减轻了高脂饮食诱导的小鼠肝脂肪变性。

图7 肝脏切片的HE染色

总结

基于WGCNA，作者确定了与NAFLD相关的候选中心lncRNA和mRNA，并构建了lncRNA-mRNA共表达网络和lncRNA-mRNA通路共表达网络。作者的分析揭示了中心lncRNA可能调节与NAFLD发病密切相关的炎症和代谢途径。此外，番茄红素具有成为预防HFD诱导的肝脂肪变性的植物化学物质的潜力。因此，未来的研究人员应该调查番茄红素与关键lncRNA在NAFLD中的调控作用。