铜代谢+铜死亡，两大生信热点，结合WGCNA+实验轻松上5+

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铜代谢+铜死亡，两大生信热点，结合WGCNA+实验轻松上5+

今天给同学们分享一篇铜代谢+铜死亡，两大生信热点的生信文章“Contribution of cuproptosis and Cu metabolism-associated genes to chronic obstructive pulmonary disease”，这篇文章于2023年10月6日发表在J Cell Mol Med 期刊上，影响因子为5.3。

慢性阻塞性肺病（COPD）是由于大量接触香烟烟雾等有毒气体和微粒而引起的持续性气流阻塞。 慢性阻塞性肺病是一种以肺气肿、慢性支气管炎和小气道阻塞为特征的进行性疾病，表现为呼吸困难、咳嗽和咳痰。慢性阻塞性肺病已成为致残的主要原因，也是全球第三大常见死因，2019 年， 占死亡人数的 323 万。慢性阻塞性肺病的主要风险因素包括室外和室内空气污染（如用于取暖和烹饪的生物燃料）、职业性粉尘、化学品，尤其是吸烟。  虽然慢性阻塞性肺病的发病机制尚不清楚，但其特征是氧化应激、 免疫和炎症、 细胞凋亡、 上皮变性损伤、粘液分泌过多和气道纤维化。 

1.COPD 中铜氧化酶和铜代谢相关基因的表达

分析的最初重点是评估慢性阻塞性肺病样本和对照样本中 52 个杯突症和铜代谢相关基因的差异表达。在慢性阻塞性肺病组中，共发现了 18 个差异表达基因（DEGs）（见图 1A、B）。值得注意的是，在这些 DEGs 中，有 5 个基因先前已被报道与杯突症有关 （见图 1C）。总之，这些研究结果表明，铜氧化酶和铜代谢相关基因是慢性阻塞性肺病的病因。

图1 COPD 患者和对照组铜代谢相关基因的表达

2. 铜代谢相关基因的 PPI 网络分析

为了确定 COPD 疾病中 18 个铜代谢相关基因之间的相互作用，作者进行了 PPI 网络分析。这些基因经常发生相互作用（图 2A），表明它们之间存在合作关系。其中，MTE1 与其他蛋白的相互作用更为密切。因此，作者进一步研究了这些基因的表达相关性。作者观察到杯突症调节因子之间存在高度一致的相关性（图 2B,C）；例如，DLD、PDHB、MTF1、GLS 或 CDKN2A 与其他杯突症相关介导因子显著相关（0.19 < |R| < 0.80，p < 0.05）。总之，这些发现意味着铜代谢相关基因之间的串扰存在于慢性阻塞性肺病的发病过程中。此外，作者还利用 GSE20257 的表达谱数据构建了一个 WGCNA 网络，以探索与慢性阻塞性肺病相关的共表达网络。在 GSE20257 数据集中发现的 15 个模块中，黑色模块（由 1018 个基因组成）与 COPD 表型具有高度相关性（R 2 = 0.56，p = 6e −11 ）。随后，作者将 GSE20257 黑色模块中的基因与铜代谢相关基因重叠，结果发现了五个共同基因。

图2 铜代谢相关基因表达之间的相关性

3.铜代谢相关基因与慢性阻塞性肺病关键基因的相关性

在之前的一份报告中，作者筛选出了 27 个慢性阻塞性肺病的关键基因。25 作者对这 27 个关键基因和 18 个铜代谢相关基因进行了 PPI 相互作用分析。在 PPI 网络分析中，作者观察到铜代谢相关基因 DLD 与 COPD 关键基因 GPX2 之间存在相互作用，GPX2 属于谷胱甘肽过氧化物酶家族（GPXs，GSH-Px）。之前的研究报告称，慢性阻塞性肺病患者的肌肉 EGF 转录水平与 ST 纤维比例之间存在负相关关系， 26 ，而作者的 PPI 结果表明 CDKN2A 与 EGF 之间存在相互作用。值得注意的是，CDKN2A 与几个关键的慢性阻塞性肺病基因有潜在的相互作用（见图 3）。这些发现表明，这些模块中的铜代谢相关基因与慢性阻塞性肺病密切相关。

图3

4.富集分析

对铜代谢相关的 18 个 DEGs 进行了 GO 和 KEGG 分析，以确定与慢性阻塞性肺病相关的可能生物过程。GO分析表明，这些基因富集于细胞过渡金属离子稳态、过渡金属离子稳态、铜离子转运、铜离子解毒、铜离子应激反应、锌离子反应、无机化合物解毒、细胞金属离子稳态、金属离子应激反应、镉离子反应，这意味着这些基因通过影响这些分子功能和生物学过程参与了慢性阻塞性肺病的发生（图4A）。KEGG分析表明，矿物质吸收、铂类药物抗性、硫辛酸代谢、柠檬酸循环（TCA循环）、2-氧代羧酸代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖元生成、癌症中枢碳代谢、影响肺部能力和肺部疾病易感性的碳代谢与慢性阻塞性肺病有关（图4B）。

图4 18 个铜代谢相关基因的 GO 和 KEGG 信号通路分析

5.&nbsp;慢性阻塞性肺病模型大鼠的肺功能和组织病理学

为了进一步验证铜氧化酶和铜代谢相关基因的调控作用，作者利用大鼠建立了慢性阻塞性肺病模型。肺功能可以反映慢性阻塞性肺病大鼠的气流状况。与对照组相比，COPD组的主要肺功能指标FEV0.1/FVC（P＜0.01）和FEV0.3/FVC（P＜0.01）均有所下降（图5A,B）。慢性阻塞性肺病组大鼠肺泡隔增厚、水肿并伴有炎性细胞浸润。COPD 组大鼠的肺部炎症评分和损伤指数均高于模拟组（图 5C,E）。用 PAS 对气管上皮细胞中的鹅口疮进行染色。对 PAS 阳性染色区进行检查并分析其粘液分泌和鹅口疮病变情况。组织学评估显示，COPD 大鼠的鹅口疮细胞增殖增加，CS 诱导的粘液阻塞（图 5D、F）。

图5 慢性阻塞性肺病大鼠的肺功能和组织病理学

6.慢性阻塞性肺病模型大鼠肺组织中铜的增加和铜调节因子的异常表达

随后，根据上述 COPD 临床患者的测序数据，作者建立了 COPD 大鼠模型，并检测了一些参与杯突形成的关键调控因子，其中包括 DLD 和 CDKN2A。模型组中这两个基因的 mRNA 表达增加（图 6A,B），其蛋白水平也显著增加（图 6C-E），印迹和凝胶原图见图 S1。作者还发现慢性阻塞性肺病大鼠肺组织中铜的积累增加（图 6F）。总之，铜的异常积累和铜调节因子的异常表达预示着慢性阻塞性肺病模型大鼠可能会发生铜中毒。

图6

7.吸烟和慢性阻塞性肺病不同阶段对杯突症相关基因 DLD 和 CDKN2A 表达的影响

为了进一步研究铜杯突变相关基因与慢性阻塞性肺病之间的相关性，作者重点研究了慢性阻塞性肺病的两个重要因素：（1）吸烟（健康或慢性阻塞性肺病）与非吸烟（健康）；（2）早期慢性阻塞性肺病与已确立的慢性阻塞性肺病。作者选择了两个关键的杯突症相关基因 DLD 和 CDKN2A 进行分析。结果显示，这两个基因在健康吸烟者和健康非吸烟者之间的表达存在明显差异（p< 0.05)（图 7A,B）。在比较早期慢性阻塞性肺病患者和已确诊的慢性阻塞性肺病患者之间的表达水平时，没有发现明显差异（p > 0.05）（图 7C,D）。这表明这些杯突相关基因的表达并没有随着慢性阻塞性肺病的进展而发生显著变化。总之，作者的研究结果表明，吸烟对增加这些基因的表达有一定的促进作用，但在 COPD 早期组和成熟组之间没有发现表达水平的差异。

图7 杯突相关基因 DLD 和 CDKN2A 的表达

总结

总之，作者的研究表明，DLD和CDKN2A在慢性阻塞性肺病中表达，具有杯突症介质的功能作用。它们在慢性阻塞性肺病患者的气道上皮细胞中表达异常，而吸烟对增加它们的表达有一定的促进作用。这一点已在慢性阻塞性肺病模型大鼠身上得到验证。慢性阻塞性肺病的发生与铜调节基因有关。这些基因是如何被调控的，它们之间的异常相互作用是否会导致慢性阻塞性肺病的发生，这些问题仍有待进一步探讨。